糖皮質(zhì)激素對馬兜鈴酸腎病的臨床及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分低劑量糖皮質(zhì)激素對不同程度腎損傷的慢性馬兜鈴酸腎病患者病情進(jìn)展的影響及可能機(jī)制
　　 目的:馬兜鈴酸腎病(Aristolochic acid nephropathy,AAN)是馬兜鈴類中草藥引起的腎小管間質(zhì)疾病。我國AAN以慢性最為多見,其病理損害大多數(shù)表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化。大量研究表明,各種腎間質(zhì)纖維化均可能有炎癥參與或有免疫因素參與。迄今為止,對慢性AAN尚無成熟的治療方案。近年來,國內(nèi)外已有少量關(guān)于糖皮質(zhì)激素治療慢性

2、AAN的報告,提示糖皮質(zhì)激素對延緩AAN進(jìn)展有一定療效。本研究應(yīng)用低劑量糖皮質(zhì)激素對伴有輕中度及重度腎功能不全的慢性AAN患者進(jìn)行治療,重點(diǎn)觀察該治療對慢性AAN的病程有無有益作用。
　　 方法:選擇北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科1998年11月～2010年4月臨床診斷慢性AAN患者共79例進(jìn)入本研究。根據(jù)治療前血清肌酐水平分為輕中度腎功能不全組(血肌酐＜354μmol/1,42例)和重度腎功能不全組(血肌酐≥354μmol/1,37例)。

3、輕中度腎功能不全組AAN患者分為激素治療組(n=18)與對照組(n=24),兩組患者在性別分布(P=0.839)、年齡(P=0.39)、治療前各項(xiàng)血生化指標(biāo)、血紅蛋白及血壓等方面均無顯著差異。重度腎功能不全組AAN患者分為激素治療組(n=23)與對照組(n=14),兩組在性別分布(P=0.353)、年齡(P=0.262)、治療前各項(xiàng)血生化指標(biāo)、血紅蛋白及血壓等方面均無顯著差異。對輕中度腎功能不全患者隨診觀察2年,重度腎功能不全患者隨診觀

4、察1年。分別對兩組患者的血清肌酐值進(jìn)行自身前后和組間比較,以評價激素治療對腎功能不全的慢性AAN患者的病程進(jìn)展有無影響；同時對接受糖皮質(zhì)激素治療的輕中度與重度腎功能不全患者的臨床轉(zhuǎn)歸進(jìn)行比較分析,以評價不同程度。腎功能不全的AAN患者從激素治療中的獲益有無差別。
　　 結(jié)果輕中度腎功能不全的AAN患者,激素治療組在2年隨訪時間內(nèi)血肌酐基本維持穩(wěn)定,與治療前比較無顯著差異(P＞0.05)；對照組患者在隨診中血肌酐緩慢進(jìn)行性升高,在

5、9～24月的各時間點(diǎn)與治療前比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。輕中度腎功能不全的AAN患者中激素治療組與對照組兩組間比較,在9～24月的各時間點(diǎn),激素治療組的血清肌酐均顯著低于對照組(P＜0.05)。
　　 重度腎功能不全的AAN患者,激素治療組血肌酐在6月內(nèi)逐步下降,與初始比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；9月、12月血肌酐值略有回升,與治療前相比無明顯差異。而對照組患者血肌酐持續(xù)緩慢升高,6月、9月、12月時與初始比較均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差

6、異。重度腎功能不全的AAN患者中激素治療組與對照組兩組間比較,在6～12月的各時間點(diǎn),激素治療組的血清肌酐均顯著低于對照組(P＜0.05)。
　　 接受糖皮質(zhì)激素治療的患者,重度腎功能不全組與輕中度腎功能不全組比較,兩組患者在總隨訪時間內(nèi)治療有效率無明顯差異。
　　 所有患者在隨診過程中血生化指標(biāo)、血壓、血紅蛋白等均無明顯變化。激素治療組患者,尿轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,FGF)

7、-β1和單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein,MCP)-1明顯下降。治療過程中的不良反應(yīng)輕微,僅部分患者出現(xiàn)類固醇糖尿病和帶狀皰疹病毒感染,2例高齡患者發(fā)生股骨頭壞死。
　　 結(jié)論低劑量糖皮質(zhì)激素能逆轉(zhuǎn)或延緩輕中度及重度腎功能不全的慢性 AAN患者病情進(jìn)展,該種保護(hù)作用在治療后3個月內(nèi)即出現(xiàn),至少可維持1～2年；低劑量糖皮質(zhì)激素安全性較好,多數(shù)患者可耐受；糖皮質(zhì)激素可降低尿 TGF-

8、β1和MCP-1的水平,可能是其治療慢性AAN的作用機(jī)制之一。
　　 第二部分馬兜鈴酸腎病合并范可尼綜合征患者臨床及生化特點(diǎn)分析
　　 目的:小劑量馬兜鈴酸(Aristolochic acid,AA)作用于腎小管上皮細(xì)胞,可使該細(xì)胞變性、萎縮,出現(xiàn)腎小管功能障礙型 AAN,主要表現(xiàn)為腎小管酸中毒和/或Fanconi綜合征(Fanconi syndrome,FS)。目前國內(nèi)外已有少量關(guān)于AAN伴Fanconi綜合征的個案報

9、道,尚未見大宗臨床觀察。目前漏診、誤診仍常有發(fā)生,為了提高臨床醫(yī)生對AAN合并Fanconi綜合征患者的認(rèn)識,本研究對AAN合并Fanconi綜合征患者的臨床表現(xiàn)及生化特點(diǎn)進(jìn)行分析。
　　 方法:回顧性分析1998年11月～2010年9月北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科診斷AAN’合并Fanconi綜合征患者38例(初始血肌酐≤354μmol/l),男性10例,女性28例,平均年齡為55.81±14.14歲。根據(jù)是否應(yīng)用激素治療分為一般治療組

10、(n=10)和激素治療組(n=28)。對所有患者隨診觀察1年,主要觀察患者的臨床表現(xiàn)、血生化指標(biāo)、血?dú)夥治鲋笜?biāo)、尿糖、尿氨基酸定性、尿β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)等指標(biāo)以及治療反應(yīng)。
　　 結(jié)果:患者臨床癥狀以乏力(68.42％)、惡心納差(42.11％)、夜尿增多(15.79％)和腰背痛(21.05％)為主要表現(xiàn),部分患者有明顯多飲多尿(26.32％),表現(xiàn)為骨痛、手足抽搐及泌尿系感染者均占5.

11、26％。
　　 所有患者均有明顯高氯性代謝性酸中毒,3例患者行碳酸氫根重吸收排泄試驗(yàn)給予了證實(shí)?；颊哂忻黠@物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,包括低磷血癥17例(44.74％)、低尿酸血癥12例(31.58％)、腎性糖尿(100％)、氨基酸尿(72.2％)和低分子量蛋白尿(24小時尿蛋白1.06±0.58g),尿β2-MG明顯升高(2855.12±3488.98ng/l)。4例患者接受腎活檢,結(jié)果顯示有明顯小管-間質(zhì)病變。
　　 隨訪過程中,

12、對照組患者大多數(shù)進(jìn)入透析,尿糖持續(xù)存在。糖皮質(zhì)激素治療組大多數(shù)患者腎功能維持穩(wěn)定,尿氨基酸轉(zhuǎn)陰,部分患者尿糖消失。所有患者12月時尿β2-MG明顯降低(879.08±694.19ng/l),血尿酸、血磷有所恢復(fù),分別為273.30±81.27μmol/l和1.15±0.23 mmol/l,和初始相比均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:馬兜鈴酸腎病可合并Fanconi綜合征,完善相關(guān)檢查可明確診斷；糖皮質(zhì)激素對AAN

13、繼發(fā)的范可尼綜合征有一定療效。
　　 第三部分地塞米松對馬兜鈴酸誘導(dǎo)HKC細(xì)胞上皮.間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用
　　 目的:腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。馬兜鈴酸可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMI’轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞,還可能通過細(xì)胞間“交叉對話”(如釋放細(xì)胞因子等)作用于間質(zhì)成纖維細(xì)胞,激活后者合成及分泌大量細(xì)胞外基

14、質(zhì),致使腎間質(zhì)纖維化。近年來,有報道應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療馬兜鈴酸腎病,但其機(jī)制尚不十分清楚。
　　 本部分的研究目的是探討地塞米松(Dexamethasone,Dex)對AA誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)發(fā)生EMT的作用。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)分組為:(1)正常對照組；(2)AA刺激組(10μg/ml)；(3)地塞米松作用組(100μmol/l)；(4)AA(10μg/ml)+無水乙醇(100μmol/l)組；(5)AA

15、(10μg/ml)+不同劑量的地塞米松(100、10、1、0.1、0.01μmol/1)共同處理48小時。應(yīng)用激光共聚焦方法檢測HKC細(xì)胞α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)、E-鈣粘素(E-cadherin)的表達(dá),Real-time PCR、Western Blot方法檢測α-SMA、E-鈣粘素的表達(dá)強(qiáng)度,ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中纖維連接蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ型膠原(col

16、lagenⅠ,COLⅠ)的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)分組為:(1)正常對照組；(2)AA刺激組(10μg/ml)；(3)地塞米松作用組(100μmol/l)；(4)AA(10μg/ml)+地塞米松(100μmol/l)共同處理0、6、12、24、48小時。Real-time PCR、Western Blot方法檢測α-SMA、E-鈣粘素的表達(dá)強(qiáng)度,ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中FN、COLⅠ的表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。
　　

17、 結(jié)果:
　　 1.激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),作用48小時,與陰性對照組比較,AA作用組和AA+無水乙醇組E-鈣粘素表達(dá)明顯減弱,α-SMA表達(dá)明顯增強(qiáng),單獨(dú)Dex作用組與陰性對照組相比無明顯變化。同AA作用組相比,Dex(100μmol/l)與AA共同作用組,α-SMA表達(dá)明顯減弱而E-鈣粘素表達(dá)明顯增加。隨Dex濃度下降,α-SMA表達(dá)逐漸增加而E-鈣粘素表達(dá)逐漸減弱。
　　 2.Real—time PCR、West

18、ern Blot和ELISA結(jié)果顯示,AA作用48小時后,HKC細(xì)胞α-SMA表達(dá)較陰性對照組顯著升高,E-鈣粘素表達(dá)顯著降低,培養(yǎng)液上清中FN、COLⅠ明顯升高(P＜0.05),而單獨(dú)Dex作用組和陰性對照組相比無明顯變化。與AA單獨(dú)作用組相比,Dex(100μmol/l)與AA共同作用組α-SMA表達(dá)明顯降低,E-鈣粘素表達(dá)顯著升高,隨著與AA共同作用的Dex濃度下降,α-SMA表達(dá)和培養(yǎng)液上清中FN、COLⅠI的水平逐漸升高,E-

19、鈣粘素表達(dá)逐漸降低(P＜0.05)。
　　 3.Real-time PCR、Western Blot和ELISA結(jié)果顯示,48小時內(nèi),隨作用時間延長,AA組α-SMA和培養(yǎng)液上清中FN、COLⅠ的水平逐漸增加,E-鈣粘素表達(dá)逐漸減低,與對照組相比,在24和48小時有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。AA+Dex組α-SMA和培養(yǎng)液上清中FN、COLⅠ的水平在48小時內(nèi)逐漸下降,而E-鈣粘素的表達(dá)在48小時內(nèi)無明顯降低,和單獨(dú)AA刺

20、激組相比,48小時有明顯差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論 AA能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HKC細(xì)胞發(fā)生EMT,Dex能呈濃度依賴性地抑制 AA誘導(dǎo)HKC細(xì)胞發(fā)生EMT,主要發(fā)生于Dex干預(yù)后24和48小時。
　　 第四部分地塞米松抑制馬兜鈴酸誘導(dǎo)HKC細(xì)胞EMT過程中Smad信號途徑表達(dá)的變化
　　 目的:有研究表明,在慢性馬兜鈴酸刺激導(dǎo)致的EMT和間質(zhì)纖維化過程中,TGF-β1/Smad信號途徑起主要作用；該途徑中起關(guān)

21、鍵作用的是Smad3,在Smad3基因敲除的實(shí)驗(yàn)動物中,腎組織無明顯EMT發(fā)生。近年來,已有少量關(guān)于糖皮質(zhì)激素治療慢性AAN的報告,研究發(fā)現(xiàn)激素治療對AAN模型大鼠的腎間質(zhì)纖維化有一定程度的減輕。同時相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域研究發(fā)現(xiàn),在支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT過程中,給予地塞米松可減少α-SMA、Ⅰ型膠原和粘蛋白C的表達(dá)；在成骨細(xì)胞中,應(yīng)用地塞米松可抑制Smad3途徑的激活。本部分的研究目的是探討Dex抑NAA誘導(dǎo)HKC細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中對TG

22、F-β1/Smad信號途徑的影響。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)分組為:(1)正常對照組；(2)AA刺激組(10μg/ml)(3)地塞米松作用組(100μmol/l)(4)AA(10μg/ml)+無水乙醇(100μmol/l)組；(5)AA(10μg/ml)+不同劑量的地塞米松(100、10、1、0.1、0.01μmol/l)共同處理48小時。實(shí)時熒光定量PCR方法檢測HKC細(xì)胞的Smad7和TGF-β1 mRNA的表達(dá),Wester

23、n Blot方法檢測HKC細(xì)胞的TGF-β1、p-Smad3、Smad3和Smad7蛋白的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)分組為:(1)正常對照組；(2)AA刺激組(10μg/ml)(3)地塞米松作用組(100μmol/l)(4)AA(10gg/ml)+地塞米松(100μmol/l)共同處理0、6、12、24、48小時。實(shí)時熒光定量PCR方法檢測HKC細(xì)胞的Smad7和TGF-β1 mRNA的表達(dá),Western Blot方法檢測HKC

24、細(xì)胞的TGF-β1、p-Smad3、Smad3和Smad7蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.和陰性對照組相比,AA刺激組HKC細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)、p-Smad3和TGF-β1蛋白表達(dá)水平均顯著增高,Smad7 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降；Dex單獨(dú)作用組以上各指標(biāo)均無明顯變化。而AA+Dex組,不同濃度Dex干預(yù)后HKC細(xì)胞TGF-β1 mRNA、p-Smad3和TGF-β1蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢,S

25、mad7 mRNA和蛋白表達(dá)水平均逐漸升高,其中較高濃度的Dex處理組最顯著。
　　 2.48小時內(nèi),隨作用時間延長,AA刺激組TGF-β1 mRNA、p-Smad3和TGF-β1的蛋白表達(dá)水平均逐漸增加,Smad7 mRNA和蛋白表達(dá)逐漸下降,以24和48小時最明顯,和陰性對照組相比均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。而AA+Dex組TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)、p-Smad3蛋白表達(dá)在48小時內(nèi)均無明顯升高,Smad7 m