脊髓孤啡肽在大鼠炎癥痛及針刺鎮(zhèn)痛中的作用及其機制研究.pdf

1、L脊髓N／OFQ-NOP系統(tǒng)在大鼠炎癥痛及針刺鎮(zhèn)痛中的作用 1．1脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)注射N／OFQ對炎癥痛大鼠痛閾的影響 在大鼠后肢足底皮下注射100μlCFA建立炎癥痛模型后的第4天，大鼠隨機分成4組，分別于鞘內(nèi)注射1．5，5，15nmolN／OFQ，生理鹽水(NS)，在給藥前及給藥后10，20，30，60，90min采用輻射熱縮腿反射的方法，測定縮腿潛伏期(PWL)，以縮腿潛伏期變化的百分比((處置后PWL-處置前PW

2、L)／處置前PWL，PWLs)為觀察指標(biāo)。結(jié)果表明：15nmolN／OFQ顯著提高炎癥痛大鼠的痛閾，具有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。 1．2脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)注射N／OFQ受體拮抗劑對炎癥痛大鼠痛閾及N／OFQ鎮(zhèn)痛作用的影響 在炎癥痛模型建立后的第4天，鞘內(nèi)注射15nmolN／OFQ，5min后鞘內(nèi)給予[NpheI]nociceptin(1-13)NH2(N／0FQ受體拮抗劑)。大鼠隨機分成4組，15nmolN／OFQ，20nmol[

3、Nphe1】nociceptin(1—13)NH2，15nmolN／OFQ+20nmol[Nphe1】nociceptin(1-13)NH2，NS，在給藥前及給藥后10，20，30，60，90min測定PWL，以PWLs為觀察指標(biāo)。結(jié)果表明：N／OFQ受體拮抗劑對炎癥痛大鼠痛閾無明顯影響，但能有效阻斷N／OFQ對炎癥痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用。 1．3單次電針對炎癥痛大鼠痛閾的影響 在炎癥痛模型建立后的第4天，大鼠隨機分成3組，炎

4、癥痛組(CFA)，炎癥痛+假電針組(CFA+sham-EA)，炎癥痛+電針組(CFA+EA)。在EA治療前及治療后lO，20，30，60，90min測定PWL，以PWLs為觀察指標(biāo)。結(jié)果表明：電針能提高炎癥痛大鼠的痛閾，具有顯著的即刻鎮(zhèn)痛效應(yīng)。 1．4脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)注射N／OFQ受體拮抗劑對電針鎮(zhèn)痛作用的影響在炎癥痛模型建立后的第4天，鞘內(nèi)注射20nmol [Nphe1】nociceptin(1—13)NH2，10mi

5、n后給予30min電針治療。在EA治療前及治療后10，20，30，60，90min測定PWL，以PWLs為觀察指標(biāo)。結(jié)果表明，20nmol[Nphe1]nociceptin(1-13)NH2能部分翻轉(zhuǎn)電針對炎癥痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用。 1．5脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)注射N／OFQ對電針鎮(zhèn)痛作用的影響 2．脊髓背角N／OFQ及其受體在大鼠炎癥痛發(fā)展的不同階段以及電針治療炎癥痛時的表達(dá)變化 炎癥痛模型建立后的第l天給予電針治療，隔日

6、1次，每次30min，持續(xù)2周。采用輻射熱縮腿反射的方法，隔日測定PWL，以痛敏分?jǐn)?shù)(Hyperalgesiascore，sec，致炎側(cè)與對照側(cè)PWL的差值)為觀察指標(biāo)。結(jié)果表明：大鼠后肢皮下注射CFA24小時之內(nèi)即出現(xiàn)典型的炎癥痛癥狀，大鼠的熱痛敏在2周內(nèi)均可維持較高水平；隨著電針治療次數(shù)的增加，炎癥痛大鼠的痛敏分?jǐn)?shù)逐漸提高，說明電針具有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。5次電針以后，與對照組(CFA、CFA+sham-EA)相比，有顯著性差異。

7、 2．2脊髓ppN／OFQmRNA在大鼠炎癥痛發(fā)展的不同階段以及給予電針后的表達(dá)變化 大鼠炎癥痛模型建立后第4、10、14天，即電針治療2、5、7次，選取大鼠脊髓腰膨大段，采用RT-PCR技術(shù)觀察在大鼠炎癥痛發(fā)生、維持的不同階段以及給予電針后ppN／OFQmRNA的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：從炎癥痛模型建立第4天起，與正常組(Normal)相比，炎癥痛大鼠致炎側(cè)的脊髓ppN／OFQmRNA含量明顯增加，給予5次電針后其含量進(jìn)一步增加

8、。 而在對側(cè)脊髓中，ppN／OFQmRNA表達(dá)無顯著性變化。 2．3脊髓背角N／OFQ含量在大鼠炎癥痛發(fā)展的不同階段以及給予電針后的表達(dá)變化 大鼠炎癥痛模型建立后第4、10、14天，即電針治療2、5、7次，取脊髓腰膨大段進(jìn)行冰凍切片，選取大鼠脊髓背角作為主要觀察部位，采用免疫組織化學(xué)方法觀察在大鼠炎癥痛發(fā)生、維持的不同階段以及給予電針后N／OFQ含量的變化。結(jié)果顯示：N／OFQ免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞主要存在于脊髓背角淺

9、層；從炎癥痛模型建立第4天起，與正常組(Normal)相比，炎癥痛大鼠致炎側(cè)的脊髓背角N／OFQ免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少；與炎癥痛組(CFA)相比，給予5次電針后其免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加。 而在對側(cè)脊髓背角中，N／OFQ免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞無顯著性變化。 2．4脊髓NOPmRNA在大鼠炎癥痛發(fā)展的不同階段以及給予電針后的表達(dá)變化 大鼠炎癥痛模型建立后第4、10、14天，即電針治療2、5、7次，選取大鼠脊髓腰膨大

10、段，采用RT-PCR技術(shù)觀察在大鼠炎癥痛發(fā)生、維持的不同階段以及給予電針后NOPmRNA的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：從炎癥痛模型建立第4天起，與正常組(Normal)相比，炎癥痛大鼠致炎側(cè)的脊髓NOPmRNA含量明顯增加，給予5次電針后其含量進(jìn)一步增加。 而在對側(cè)脊髓中，NOPmRNA表達(dá)無顯著性變化。 2．5脊髓NOP蛋白在大鼠炎癥痛發(fā)展的不同階段以及給予電針后的表達(dá)變化 大鼠炎癥痛模型建立后第4、10、14天，即電

11、針治療2、5、7次，選取大鼠脊髓腰膨大段，采用Westernblot技術(shù)觀察在大鼠炎癥痛發(fā)生、維持的不同階段以及給予電針后NOP蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：從炎癥痛模型建立第4天起，與正常組(Normal)相比，炎癥痛大鼠致炎側(cè)的脊髓NOP蛋白表達(dá)明顯增加，給予5次電針后其表達(dá)進(jìn)一步增加。 而在對側(cè)脊髓中，NOP蛋白表達(dá)無顯著性變化。 小結(jié)：多次電針對大鼠炎癥痛具有顯著的累加鎮(zhèn)痛效應(yīng)。正常大鼠脊髓背角有N／OFQ和NOP的

12、表達(dá)；炎癥痛形成后，ppN／OFQmRNA、NOPmRNA、NOP蛋白表達(dá)均增加，提示脊髓N／OFQ及其受體參與慢性炎癥痛發(fā)生、維持的不同階段。此外，炎癥痛大鼠脊髓背角N／OFQ免疫陽性細(xì)胞數(shù)減少，可能是由于炎癥痛發(fā)展過程中N／OFQ釋放增加，但蛋白合成相對不足所致；炎癥痛大鼠給予電針治療后脊髓背角ppN／OFQmRNA、NOPmRNA、NOP蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，N／OFQ免疫陽性細(xì)胞數(shù)也有所增加，提示電針促進(jìn)脊髓N／OFQ及其受體的合

13、成；N／OFQ合成的進(jìn)一步增加，代償了炎癥痛過程中其大量釋放所引起的陽性細(xì)胞數(shù)減少。以上結(jié)果提示，脊髓N／OFQ及其受體參與了炎癥痛發(fā)生、維持的不同階段以及電針治療炎癥痛的過程。 3．脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能活動在大鼠炎癥痛發(fā)展的不同階段的變化大鼠隨機分成2組：正常組(Normal)，炎癥痛組(CFA)。采用免疫組織化學(xué)染色、Westernblot、RT-PCR等技術(shù)觀察在大鼠炎癥痛發(fā)展的不同階段(炎癥痛模型建立后第4、10、

14、14天)，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生肥大的指標(biāo)——膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)以及前炎性細(xì)胞因子(IL．1β、IL-6、TNF-a)表達(dá)的情況。 3．1炎癥痛發(fā)展的不同階段，脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活化的情況大鼠炎癥痛模型建立后第4、10、14天，取脊髓腰膨大段進(jìn)行冰凍切片，選取大鼠脊髓背角作為主要觀察部位，采用免疫組織化學(xué)染色方法觀察在大鼠炎癥痛發(fā)生、維持的不同階段，GFAP的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：GFAP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞主要存在于脊髓背

15、角淺層；從炎癥痛模型建立第4天起，與正常組(Normal)相比，炎癥痛大鼠致炎側(cè)的脊髓背角GFAP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加。 而在對側(cè)脊髓背角中，GFAP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞無顯著性變化。 Westernblot結(jié)果顯示：從炎癥痛模型建立第4天起，與正常組(Normal)相比，炎癥痛大鼠致炎側(cè)的脊髓GFAP蛋白表達(dá)明顯增加。 而在對側(cè)脊髓中，GFAP蛋白表達(dá)無顯著性變化。 3．2炎癥痛發(fā)展的不同階段，脊髓前

16、炎性細(xì)胞因子(IL．1β、IL-6、TNF-a)的表達(dá)情況 大鼠炎癥痛模型建立后第4、10、14天，選取大鼠脊髓腰膨大段，采用RT-PCR技術(shù)觀察在大鼠炎癥痛發(fā)生、維持的不同階段前炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：從炎癥痛模型建立第4天起，與正常組(Normal)相比，炎癥痛大鼠致炎側(cè)的脊髓IL．1β、IL-6、TNF-amRNA含量均明顯增加。而在對側(cè)脊髓中，前炎性細(xì)胞因子表達(dá)無顯著性變化。 小結(jié)：炎癥痛發(fā)生、