脊髓NMDA受體在IBS慢性內(nèi)臟痛敏及針刺對(duì)其療效中的作用.pdf

1、內(nèi)臟高敏感性(visceral hyperalgesia)是指內(nèi)臟對(duì)正常生理性或傷害性刺激的感覺(jué)閾值降低,反應(yīng)增強(qiáng),其發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜。以往研究多局限于胃腸道局部病變,如腸嗜鉻細(xì)胞和肥大細(xì)胞的活化、腸壁內(nèi)腦腸肽及其受體的表達(dá)異常等,即外周致敏機(jī)制。但內(nèi)臟感覺(jué)的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,內(nèi)臟感覺(jué)中樞傳導(dǎo)通路和大腦高級(jí)中樞的異常,包括神經(jīng)遞質(zhì)及其受體的表達(dá)和活性,均可影響對(duì)內(nèi)臟刺激的感知。
　　 腸易激綜合征(IBS)是臨床上一種常見(jiàn)病

2、,其主要臨床表現(xiàn)之一是腹痛和腹部不適,屬于一種慢性內(nèi)臟痛敏。IBS的局部腸道雖然沒(méi)有明顯器質(zhì)性病變,但研究表明IBS病人對(duì)閾下腸道刺激感覺(jué)過(guò)敏。近年來(lái)對(duì)IBS發(fā)病機(jī)制的研究顯示,脊髓中樞對(duì)內(nèi)臟感覺(jué)傳入投射區(qū)域的敏感性升高是形成IBS慢性內(nèi)臟痛敏的重要機(jī)制。脊髓背角和側(cè)角的內(nèi)臟感覺(jué)投射神經(jīng)元和中間神經(jīng)元的興奮性異常升高是形成內(nèi)臟中樞敏化的機(jī)制之一,其中一些神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)如五羥色胺遞質(zhì)受體系統(tǒng)參與發(fā)揮了作用。
　　 針刺鎮(zhèn)痛是祖國(guó)醫(yī)

3、學(xué)的瑰寶之一,具有療效確切,毒副作用少,經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外大量臨床和基礎(chǔ)研究表明,針刺治療各類疼痛包括內(nèi)臟痛具有顯著鎮(zhèn)痛作用。Al-Chaer于2001年報(bào)道了一種能夠模擬臨床IBS的大鼠模型。我們?cè)诔晒?fù)制了該IBS模型大鼠后,觀察了電針對(duì)腸易激綜合癥的治療作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針能明顯緩解模型大鼠慢性內(nèi)臟痛敏。然而目前對(duì)于上述針刺治療IBS模型大鼠慢性內(nèi)臟痛敏作用的機(jī)制研究還有待于進(jìn)一步的開(kāi)展。
　　 鑒于慢性內(nèi)臟痛的形成和發(fā)

4、展與脊髓的谷氨酸遞質(zhì)受體系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系,本研究選擇了脊髓NR1受體為研究對(duì)象,觀察和分析脊髓NR1受體在IBS慢性內(nèi)臟痛敏形成中及針刺對(duì)其療效中的作用。具體內(nèi)容報(bào)告如下:
　　 一.研究?jī)?nèi)容
　　 1.建立IBS大鼠模型參照Al-Chaer等報(bào)道的大鼠IBS模型,將雄性SD新生鼠,自出生后8天起,每天給予結(jié)直腸擴(kuò)張刺激(在這個(gè)過(guò)程中改進(jìn)造模方法,根據(jù)老鼠的狀態(tài)給予不同量的結(jié)直腸刺激),連續(xù)兩周,使其在成年后形成慢性內(nèi)

5、臟痛敏狀態(tài)。通過(guò)測(cè)定模型大鼠體重和腹瀉情況、腹部撤回反射(AWR),對(duì)模型進(jìn)行綜合評(píng)估。
　　 2.運(yùn)用神經(jīng)藥理學(xué)方法,觀察脊髓中樞NMDA受體在IBS大鼠慢性痛敏維持中的作用鞘內(nèi)埋管,給予NMDA受體拮抗劑MK-801,觀察給藥前后IBS大鼠內(nèi)臟痛敏行為的變化。
　　 3.運(yùn)用分子生物學(xué)方法,觀察脊髓中樞部位NMDA受體在IBS大鼠慢性痛敏形成過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律1)運(yùn)用Wegern Blot方法,從蛋白水平觀察NR1受體

6、的表達(dá)變化；
　　 2)運(yùn)用RT-PCR方法,從mRNA水平觀察NR1受體的表達(dá)變化。
　　 4.運(yùn)用分子生物學(xué)方法,觀察電針過(guò)程中脊髓中樞NMDA受體表達(dá)變化規(guī)律1)運(yùn)用Western Blot方法,從蛋白水平觀察電針前后NR1受體的表達(dá)改變；
　　 2)運(yùn)用RT-PCR方法,從mRNA水平觀察電針前后NR1受體的表達(dá)改變。
　　 二.研究結(jié)果
　　 1.大鼠IBS慢性內(nèi)臟痛敏模型的建立和評(píng)價(jià)<

7、br>　　 (1)IBS大鼠模型的建立參照Al—Chaer等報(bào)道的大鼠IBS模型,并對(duì)報(bào)道的造模方法進(jìn)行改進(jìn),制造成功的IBS大鼠內(nèi)臟痛敏表現(xiàn)明顯,腹瀉體征表現(xiàn)突出,內(nèi)臟痛持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。通過(guò)造模方法的改進(jìn),大大提高了模型的存活率和穩(wěn)定性。
　　 (2)成年IBS大鼠AWR評(píng)分異常升高成年IBS大鼠在清醒的狀態(tài)下,對(duì)不同強(qiáng)度的結(jié)直腸擴(kuò)張刺激(CRD)所產(chǎn)生的腹部撤回反射(AWR)進(jìn)行半定量行為評(píng)分。結(jié)果表明:與正常成年大鼠相比,在

8、各個(gè)誘發(fā)刺激強(qiáng)度下,IBS大鼠的AWR評(píng)分顯著升高。
　　 (3)成年IBS大鼠與正常大鼠腹瀉體征比較比較IBS大鼠(6周齡時(shí))和同齡正常大鼠的腹瀉體征的差異。結(jié)果表明,IBS大鼠伴有腹瀉體征發(fā)生率與同齡正常大鼠比較具有顯著性差異。該結(jié)果提示IBS大鼠具有明顯的腹瀉體征。
　　 (4)成年IBS大鼠與正常大鼠體重比較比較IBS大鼠(各個(gè)時(shí)間階段)和同時(shí)間段正常大鼠的體重差異。結(jié)果表明,IBS大鼠(各個(gè)時(shí)間階段)與同時(shí)間段

9、正常大鼠體重比較無(wú)明顯差異。提示造模本身對(duì)IBS大鼠體重?zé)o明顯影響。
　　 2.脊髓興奮性氨基酸遞質(zhì)受體系統(tǒng)在IBS大鼠慢性內(nèi)臟痛敏中的作用
　　 2.1鞘內(nèi)注射MK-801對(duì)IBS大鼠AWR評(píng)分的影響本實(shí)驗(yàn)觀察了鞘內(nèi)給予不同劑量的NMDA受體特異性拮抗劑MK-801對(duì)IBS大鼠AWR評(píng)分的影響。大鼠鞘內(nèi)埋管3天后進(jìn)行埋管位置鑒定,4天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。給藥前進(jìn)行AWR評(píng)分基礎(chǔ)值記錄。實(shí)驗(yàn)分為兩組:正常對(duì)照組(Normal)和

10、IBS模型組(Model),兩組分別給予低、中和高劑量的MK-801(分別為0.01μg、0.1μg和1μg的MK-801)。結(jié)果表明:正常對(duì)照組大鼠鞘內(nèi)注射各種劑量MK-801后AWR評(píng)分與注射前相比沒(méi)有明顯變化；IBS模型組鞘內(nèi)注射低劑量MK-801后AWR評(píng)分呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；IBS模型組鞘內(nèi)注射中劑量和高劑量MK-801后AWR評(píng)分與注射前相比顯著降低。該結(jié)果提示,i.t.MK-801可劑量相關(guān)性地降低IBS大鼠A

11、WR評(píng)分。
　　 2.2 IBS模型大鼠脊髓NR1受體mRNA的表達(dá)顯著升高運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)IBS模型大鼠脊髓NR1受體mRNA的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)分為正常組(Normal)和IBS模型組(Model)。Trizol一步法提取總mRNA。RT-PCR結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組脊髓腰膨大NR1受體mRNA表達(dá)明顯升高。
　　 2.3 IBS模型大鼠脊髓NR1受體蛋白的表達(dá)顯著升高運(yùn)用western blot方法檢測(cè)

12、IBS模型大鼠脊髓NR1受體蛋白的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)分為:正常組(Normal)和IBS模型組(Model)。western blot結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組脊髓腰膨大NR1受體蛋白表達(dá)明顯升高。
　　 3.電針緩解IBS大鼠內(nèi)臟痛敏本實(shí)驗(yàn)觀察了單次電針在短時(shí)間內(nèi)(停針后20min)對(duì)IBS大鼠AWR的影響。實(shí)驗(yàn)分為四組:正常對(duì)照組(Normal),模型組(Model),模型加電針組(Model+EA)和模型加假電針組(Mod

13、el+Sham EA)。結(jié)果表明:在不同強(qiáng)度(20,40,60,80mmHg)的內(nèi)臟痛誘發(fā)刺激下,與模型組相比,模型加電針組AWR評(píng)分明顯降低,而假電針組無(wú)明顯改變。提示單次電針在短時(shí)間內(nèi)可以明顯地緩解內(nèi)臟痛敏。
　　 4.脊髓興奮性氨基酸遞質(zhì)受體系統(tǒng)在電針緩解IBS慢性內(nèi)臟痛中的作用
　　 4.1電針降低IBS大鼠脊髓NR1受體mRNA的表達(dá)運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)電針對(duì)IBS模型大鼠脊髓NR1受體mRNA表達(dá)的影響。

14、實(shí)驗(yàn)分為:正常組(Normal)、IBS模型組(Model)、模型加電針組(Model+EA)和模型加假電針組(Model+Sham EA)。RT-PCR結(jié)果顯示,與模型組相比,模型加電針組脊髓腰膨大NR1受體mRNA表達(dá)明顯降低；而模型加假電針組無(wú)明顯變化。
　　 4.2電針降低IBS大鼠脊髓NR1受體蛋白的表達(dá)運(yùn)用western blot方法檢測(cè)電針對(duì)IBS模型大鼠脊髓NR1受體蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)分為:正常組(Normal

15、)、IBS模型組(Model)、模型加電針組(Model+EA)和模型加假電針組(Model+Sham EA)。Western blot結(jié)果顯示,與模型組相比,模型加電針組脊髓腰膨大NR1受體蛋白表達(dá)明顯降低,而模型加假電針組無(wú)明顯變化。
　　 三、研究結(jié)論
　　 1.制作成功的IBS大鼠模型能較好地模擬了臨床IBS的表現(xiàn):腹痛表現(xiàn)明顯,腹瀉體征表現(xiàn)突出,是一個(gè)比較穩(wěn)定的慢性內(nèi)臟痛敏動(dòng)物模型。通過(guò)造模方法的改進(jìn),大大提高