雌激素在頭痛模型大鼠中的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制.pdf

1、目的:
　　1.利用本課題組已建立的電刺激上矢狀竇頭痛大鼠模型，在大鼠去除卵巢后，觀察雌激素替代治療對(duì)其疼痛行為學(xué)的改變，評(píng)估雌激素對(duì)頭痛模型大鼠行為學(xué)的影響。
　　2.用微透析分析雌激素替代治療前后延腦頭端腹內(nèi)側(cè)(RVM)內(nèi)谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)釋放情況，探討雌激素在中樞內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的調(diào)控作用。
　　方法:
　　1.電刺激上矢狀竇去卵巢頭痛大鼠模型的建立
　　健康雌性SD大鼠行雙側(cè)卵

2、巢切除術(shù)，恢復(fù)14天后，隨機(jī)分成卵巢切除組(ovariectomy group，OVX)和雌激素替代組(estrogen receplcement group，OVX+E)，在大鼠頸背部松弛皮下，OVX組大鼠植入空膠囊，OVX+E組大鼠植入17β-雌二醇膠囊，膠囊在體內(nèi)能維持4-6周。將硅膠管植入后第3天、7天、14天、21天和28天作為時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行電刺激，觀察兩組大鼠疼痛行為學(xué)變化。在實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)的前1天，大鼠麻醉后，頭正中部剪毛，

3、固定于腦立體定位儀上，切開大鼠頭部的皮膚和肌肉直至顱骨后，牙科鉆在大鼠顱骨中線與冠狀縫相交點(diǎn)前4mm及后6 mm處分別鉆開兩個(gè)直徑約1 mm的圓孔，暴露上矢狀竇，將它們作為刺激孔，將金屬電極一前一后置于刺激孔硬腦膜之上，牙科粉固定后縫合頭部皮膚。以上所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，恢復(fù)1天后在清醒狀態(tài)下給予電刺激。
　　2.微透析分析
　　2.1預(yù)埋微透析引導(dǎo)管
　　大鼠麻醉后固定于腦立體定位儀上，在大鼠頭部放置刺激電極的

4、同時(shí)，將微透析引導(dǎo)管經(jīng)腦立體定位儀植入大鼠延腦頭端腹內(nèi)側(cè)(RVM)部位，整個(gè)手術(shù)在無(wú)菌條件下完成。
　　2.2體外微透析探針相對(duì)回收率測(cè)定
　　分別配制100μg/L的谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后將微透析探針放置于已經(jīng)配置好的兩種標(biāo)準(zhǔn)品的溶液中，設(shè)定人工腦脊液(ACSF)的流速1.5μL/min，恒定流速灌注平衡1h后，連續(xù)收集3管微透析液，每20分鐘1管。應(yīng)用高效液相色譜檢測(cè)透析液中Glu（或G

5、ABA）濃度。
　　探針的體外相對(duì)回收率=透析液Glu(或GABA)濃度/標(biāo)準(zhǔn)液Glu(或GABA)濃度×100％。
　　2.3微透析活體取樣
　　大鼠埋置微透析引導(dǎo)管1d后，先取出引導(dǎo)管內(nèi)芯，然后將微透析探針經(jīng)引導(dǎo)管插入大鼠腦RVM區(qū)，設(shè)定ACSF灌流速度為1.5μL/min，恒定速度灌流。平衡1h后，連續(xù)收集3管RVM微透析液，每管收集20分鐘，然后電刺激大鼠上矢狀竇10分鐘，再次連續(xù)收集3管RVM微透析液，微透析

6、液樣品直接進(jìn)行測(cè)定。
　　RVM細(xì)胞外Glu（或GABA）濃度=透析液Glu(或GABA)濃度/探針體外回收率。
　　2.4確認(rèn)微透析探針部位
　　微透析結(jié)束后，向微透析部位內(nèi)注入氨基黑(1μL)，然后處死大鼠，完整取出大鼠腦組織，腦組織切片確認(rèn)微透析探針部位在RVM內(nèi)。
　　結(jié)果:
　　1.OVX組大鼠在第3天、7天、14天、21天和28天時(shí)血清雌激素濃度分別為71.23±5.00 pmol/L、62±1

7、.37 pmol/L、79.89±5.91 pmol/L、61.08±3.53 pmol/L和49.94±6.18 pmol/L; OVX+E組大鼠在第3天、7天、14天、21天和28天時(shí)血清雌激素濃度分別為242.08±16.57 pmol/L、126.4±25.5 pmol/L、95.81±1.20 pmol/L、77.06±11.33 pmol/L和43.31±4.37 pmol/L; OVX+E組大鼠與OVX組相比，血清雌激素濃

8、度在第3天和第7天時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在第14天后的各時(shí)間點(diǎn)OVX+E組大鼠血清雌激素濃度逐漸下降，與OVX組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＞0.05)。
　　2.OVX組大鼠和OVX+E組大鼠在電刺激上矢狀竇時(shí)均出現(xiàn)過度理毛和扭頭這兩種疼痛行為學(xué)表現(xiàn)。
　　3.OVX組大鼠過度理毛時(shí)間在第3天、7天、14天、21天和28天時(shí)分別為11(0-20)s、7.5(0-16)s、14(6-21)s、14.5(3-23)s

9、和19.5(6-48)s;OVX+E組大鼠過度理毛時(shí)間在第3天、7天、14天、21天和28天時(shí)分別為0(0-16)s、4(0-12)s、9(2-12)s、10(0-16)s、14.5(0-34)s。在第3天時(shí)，OVX組大鼠過度理毛時(shí)間長(zhǎng)于OVX+E組，兩組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組大鼠的過度理毛時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，且兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＞0.05)
　　4.OVX組大鼠扭頭次數(shù)在第3天、7天、1

10、4天、21天和28天時(shí)分別為12.5(0-20)次、13(5-23)次、15(7-28)次、17(0-29)次和35.5(12-77)次;OVX+E組大鼠扭頭次數(shù)在第3天、7天、14天、21天和28天時(shí)分別為6(0-12)次、5(3-11)次、7(3-17)次、5(0-16)次和28(0-41)次。OVX組大鼠在第3天、7天和14天時(shí)扭頭次數(shù)要多于OVX+E組，兩組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組大鼠的扭頭次

11、數(shù)逐漸增多，且兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＞0.05)。
　　5.OVX組大鼠在第3天、7天、14天、21天和28天時(shí)電刺激上矢狀竇前RVM區(qū)微透析液中Glu濃度分別為3.94±1.11μmol/L、4.54±1.57μmol/L、1.66±0.72μmol/L、2.90±1.74μmol/L和1.33±0.35μmol/L，電刺激上矢狀竇后RVM區(qū)微透析液中Glu濃度較刺激前均有上升，電刺激上矢狀竇后RVM區(qū)微透析液中Glu濃度

12、分別為10.41±1.11μmol/L、6.5±1.23μmol/L、3.65±0.21μmol/L、4.17±0.39μmol/L和2.88±0.48μmol/L，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)電刺激前后Glu濃度相比，在第3天時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在第7天及以后的時(shí)間點(diǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＞0.05);OVX+E組大鼠在第3天、7天、14天、21天和28天時(shí)電刺激上矢狀竇前RVM區(qū)微透析液中Glu濃度分別為4.63±0.75μmol/L

13、、2.05±0.74μmol/L、3.67±2.82μmol/L、0.94±0.21μmol/L和1.23±0.71μmol/L，電刺激上矢狀竇后RVM區(qū)微透析液中Glu濃度也高于刺激前，電刺激上矢狀竇后RVM區(qū)微透析液中Glu濃度分別為7.51±0.35μmol/L、8.28±1.61μmol/L、5.73±2.63μmol/L、2.28±0.71μmol/L和1.95±0.61μmol/L，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)電刺激前后Glu濃度相比，在第3

14、天、7天和14天時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在第21天和28天時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＞0.05);OVX+E組大鼠電刺激前后Glu濃度的比值在第3天和7天時(shí)與OVX組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＜0.05)，此后兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＞0.05)。
　　6.OVX組大鼠在第3天、7天、14天、21天和28天時(shí)電刺激上矢狀竇前RVM區(qū)微透析液中GABA濃度分別為7.94±1.69μmol/L、6.59±2.18μmol/L

15、、6.31±0.91μmol/L、3.82±0.24μmol/L和2.54±0.51μmol/L，電刺激上矢狀竇后RVM區(qū)微透析液中GABA濃度較刺激前均有下降，分別為4.20±0.56μmol/L、5.63±2.02μmol/L、4.33±1.03μmol/L、3.00±0.36μmol/L和1.39±0.42μmol/L，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)電刺激前后GABA濃度相比，在第3天和7天時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在第14天及以后的時(shí)間點(diǎn)

16、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＞0.05);OVX+E組大鼠在第3天、7天、14天、21天和28天時(shí)電刺激上矢狀竇前RVM區(qū)微透析液中GABA濃度分別為6.27±1.02μmol/L、4.85±1.72μmol/L、6.11±2.4μmol/L、4.77±1.93μmol/L和3.79±1.14μmol/L，電刺激上矢狀竇后RVM區(qū)微透析液中GABA濃度也低于刺激前，分別為4.05±0.38μmol/L、2.11±0.49μmol/L、4.51

17、±1.67μmol/L、3.07±1.64μmol/L和1.40±0.27μmol/L，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)電刺激前后GABA濃度相比，僅在第3天時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在第7天及以后的各時(shí)間點(diǎn)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＞0.05);OVX+E組大鼠電刺激前后GABA濃度的比值在第7天時(shí)與OVX組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＜0.05);此后兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＞0.05)。
　　7.OVX+E組大鼠電刺激后Glu與GABA濃度

18、的比值與電刺激前Glu與GABA濃度的比值相比，在第3天和7天時(shí)與OVX組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＜0.05);在第14天及以后的時(shí)間點(diǎn)，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＞0.05)。OVX+E組大鼠電刺激后Glu與GABA濃度的比值在第3天和7天時(shí)與OVX組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＜0.05);在第14天及以后的時(shí)間點(diǎn)，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.雌激素濃度的變化可影響頭痛大鼠的行為學(xué)變化，較高