雌激素減輕大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　低氧性肺動(dòng)脈高壓(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary hypertension,PH)中的一個(gè)亞型,常見(jiàn)于罹患慢性阻塞性肺疾病與久居高原的人群。HPH以血管壁的增厚與重建為主要特征,其病理生理學(xué)基礎(chǔ)包括低氧性肺血管收縮(Hypoxic pulmonary vasoconstriction,HPV),肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的肥大增殖,以及后期的肺動(dòng)脈血管的

2、重構(gòu)(Pulmonary vascular remodeling,PVR)和肺動(dòng)脈壓力升高。肺動(dòng)脈血管的結(jié)構(gòu)重構(gòu)和晚期右心室功能衰竭是PH患者病情惡化及導(dǎo)致死亡的主要原因。小動(dòng)脈壁的肌層增厚與無(wú)肌層小動(dòng)脈肌化是HPH病理學(xué)改變的主要特征。
　　研究發(fā)現(xiàn)HPH的發(fā)病存在有明顯的性別差異,高原低氧環(huán)境中女性發(fā)病率遠(yuǎn)低于男性,且女性患者臨床表現(xiàn)也相對(duì)較輕;后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)雌激素在其中發(fā)揮了舒張血管、降低肺動(dòng)脈壓力等重要作用。因此,進(jìn)一步揭示

3、雌激素對(duì)HPH的保護(hù)作用及機(jī)制,尋找新的安全有效的外源性雌激素,將為早期干預(yù)和治療PH提供新的作用靶點(diǎn)及手段。本實(shí)驗(yàn)擬從動(dòng)物整體、器官與細(xì)胞水平觀察內(nèi)源性雌激素、外源性雌激素和植物性雌激素對(duì)HPH的作用并深入探討其作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　從整體、血管和細(xì)胞水平三個(gè)層次探討內(nèi)源性、外源性及植物雌激素對(duì)HPH的防治作用,進(jìn)一步從細(xì)胞周期、炎癥、氧化應(yīng)激等方面揭示雌激素在防治HPH作用中的機(jī)制:
　　(1)探討內(nèi)源性

4、雌激素在HPH發(fā)生過(guò)程中的作用與機(jī)制。
　　(2)研究AKT/Skp2/P27kip1途徑在雌激素防治HPH中的作用。
　　(3)探究植物性雌激素在防治HPH中的作用及其作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　一、觀察并探討內(nèi)源性雌激素在HPH中的作用及機(jī)制
　　我們分別在動(dòng)物、肺動(dòng)脈血管環(huán)和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞水平進(jìn)行研究。首先將成年雌性、雄性、懷孕及卵巢切除的SD大鼠(Sprague-Dawley rats)隨機(jī)分

5、為常氧組和低氧組等不同的8個(gè)組。常氧組置于自然條件(西安地區(qū)大氣壓力約為718 mmHg,pO2為150.6 mmHg),低氧組置于低氧艙中減壓至380 mmHg(相應(yīng)的pO2減至79.6 mmHg,相當(dāng)于海拔5000米高度的氧分壓),連續(xù)21天復(fù)制HPH的大鼠模型,觀察對(duì)比各組大鼠的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),如右心室收縮壓(Right ventricular systolic pressure,RVSP)、平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmona

6、ry arterial pressure,mPAP)及肺動(dòng)脈的病理結(jié)構(gòu)變化等指標(biāo)。其次,將雄性和不同動(dòng)情周期的雌性大鼠麻醉后取肺動(dòng)脈第3級(jí)血管(血管外徑<300μm),將血管條浸置于37℃的Krebs-Henseleit液中并通有混合氣(95％O2:5%CO2)條件下60分鐘,再更換為低氧混合氣(95%N2:5%O2),分別用雌激素受體調(diào)節(jié)劑雷洛昔芬和MAPK抑制劑U0126(MAPK為雌激素膜受體GPR30的下游通路)進(jìn)行干預(yù),并用放

7、射性免疫法測(cè)定各組大鼠的內(nèi)源性雌激素的水平,觀察內(nèi)源性雌激素的生理性變化在急性低氧條件下對(duì)肺動(dòng)脈血管收縮的作用。最后,采用取自不同性別和動(dòng)情周期的大鼠肺動(dòng)脈,原代培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞,并于2%低氧條件下培養(yǎng),分別用雷洛昔芬和U0126進(jìn)行干預(yù),[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入法測(cè)定低氧引起的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖,進(jìn)而觀察內(nèi)源性雌激素水平與低氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的關(guān)系。
　　二、觀察外源性雌激素在HPH中的作用及探討P27kip1是否參與

8、其內(nèi)在保護(hù)機(jī)制
　　我們?cè)趶?fù)制雄性大鼠HPH模型的基礎(chǔ)上,同時(shí)給予外源性雌激素β-雌二醇干預(yù),觀察大鼠HPH相關(guān)的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)與肺小動(dòng)脈的病理形態(tài)學(xué)改變,通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)、逆轉(zhuǎn)錄PCR方法測(cè)定了肺組織與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中與細(xì)胞周期相關(guān)的AKT/Skp2/P27kip1等關(guān)鍵分子,并結(jié)合β-雌二醇對(duì)低氧導(dǎo)致的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響,在整體和細(xì)胞水平探討外源性雌激素是否通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期而發(fā)揮對(duì)HPH的保護(hù)作用。
　　三、觀

9、察并初步闡釋植物性雌激素白藜蘆醇對(duì)HPH的保護(hù)作用與機(jī)制
　　為了尋找防治效果好,副作用小的化合物,我們進(jìn)一步觀察植物雌激素白藜蘆醇對(duì)HPH的防治作用。在整體水平,復(fù)制雄性大鼠HPH模型,同時(shí)給予植物雌激素白藜蘆醇(40 mg/kg/day,灌胃),同樣觀察大鼠HPH相關(guān)的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)與肺小動(dòng)脈的病理形態(tài)學(xué)改變,采用免疫組織化學(xué)染色方法觀察大鼠肺動(dòng)脈血管組織周?chē)难装Y細(xì)胞浸潤(rùn),Realtime-PCR檢測(cè)肺組織中IL-6、TNF

10、-α等炎癥介質(zhì)的表達(dá),并采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)等方法觀察與炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的HIF-1α、NF-κB、Nrf-2/Trx-1、H2O2、GSH、SOD等各關(guān)鍵分子的表達(dá)變化;在細(xì)胞水平低氧培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的同時(shí),給予不同濃度的植物雌激素白藜蘆醇進(jìn)行干預(yù),同時(shí)給予雌激素受體抑制劑ICI182780阻斷雌激素受體,采用WST-1實(shí)驗(yàn)觀察植物雌激素白藜蘆醇對(duì)低氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響,另外通過(guò)使用HIF-1α抑制劑KC7F2抑制HIF-1

11、α,并分別用AKT和ERK抑制劑LY294002和PD98059抑制AKT通路與ERK通路,進(jìn)一步從炎癥和氧化應(yīng)激兩方面揭示植物雌激素白藜蘆醇對(duì)大鼠HPH和低氧性肺動(dòng)脈平滑肌增殖的影響及其機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1)內(nèi)源性雌激素的生理性變化可以影響大鼠HPH的發(fā)生發(fā)展,雌激素水平高的雌性低氧組大鼠比雄性低氧組大鼠表現(xiàn)出較輕的RVSP、mPAP等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的升高與肺小動(dòng)脈壁增厚等表現(xiàn),其中雌激素水平最高的孕鼠HPH參數(shù)

12、變化最輕;而卵巢切除低氧組大鼠的雌激素水平接近于雄性大鼠,其RVSP、mPAP升高幅度及肺小動(dòng)脈壁增厚等表現(xiàn)也接近于雄性低氧組。離體血管實(shí)驗(yàn)顯示,與雄性大鼠和動(dòng)情間期大鼠相比,取自雌激素水平較高的動(dòng)情前期大鼠的肺動(dòng)脈血管表現(xiàn)出較輕的HPV反應(yīng),MAPK抑制劑U0126增加了HPV反應(yīng)。細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明來(lái)自雌激素水平較高的動(dòng)情前期大鼠的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)出較輕的增殖反應(yīng),雷洛昔芬與U0126干預(yù)在一定程度上增強(qiáng)了低氧導(dǎo)致的肺動(dòng)脈平

13、滑肌細(xì)胞增殖,雷洛昔芬與U0126同時(shí)干預(yù)時(shí)表現(xiàn)出疊加效應(yīng),明顯增加了低氧導(dǎo)致的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。
　　2)低氧導(dǎo)致大鼠RVSP和右心室重構(gòu)指數(shù)RVHI的明顯升高、肺小動(dòng)脈血管壁的顯著增厚;并且伴隨了肺組織中細(xì)胞周期抑制因子P27kip1的表達(dá)明顯減少,以及P27kip1特異性降解酶S期激酶蛋白2(Skp-2)與磷酸化AKT蛋白水平表達(dá)的明顯升高。外源性雌激素β-雌二醇有效減輕低氧導(dǎo)致的大鼠RVSP和右心室重構(gòu)指數(shù)RVHI的升

14、高,減輕了肺小動(dòng)脈血管壁的增厚,在減少磷酸化AKT和Skp-2表達(dá)的同時(shí)升高細(xì)胞周期抑制因子P27kip1的表達(dá);細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證大體實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并顯示β-雌二醇能夠顯著降低低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。
　　3)植物性雌激素白藜蘆醇明顯抑制大鼠HPH的發(fā)生發(fā)展,減輕低氧導(dǎo)致的右心室壓力升高與右心室重構(gòu),同時(shí)減少低氧引起的HIF-1α、NF-κB在肺組織中的表達(dá)增加,減輕了炎癥細(xì)胞在肺動(dòng)脈血管周?chē)慕?rùn)和肺組織中H2O2的生成

15、,減少低氧引起的IL-6、TNF-α等炎癥因子的mRNA水平的升高,增加了Nrf-2、Trx-1、GSH與SOD等抗氧化應(yīng)激因子的表達(dá);細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明白藜蘆醇以濃度依賴(lài)的方式減少低氧導(dǎo)致的HIF-1α在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá),并且抑制HIF-1α的表達(dá)的同時(shí)可以有效抑制低氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖,雌激素受體抑制劑ICI182780不能阻斷白藜蘆醇抑制低氧肺血管平滑肌增殖的作用,白藜蘆醇在抑制低氧導(dǎo)致的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的同時(shí)也抑制磷酸化

16、AKT和ERK的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1)內(nèi)源性雌激素在大鼠HPH發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了拮抗性作用?？赡芡ㄟ^(guò)非基因組作用途徑(GPR30受體途徑)降低HPV和基因組途徑抑制PVR和PASMCs的增殖從而發(fā)揮其拮抗HPH的作用。
　　2)外源性雌激素β-雌二醇能有效改善大鼠HPH,通過(guò)調(diào)節(jié)AKT/Skp2/P27kip1途徑抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖是其發(fā)揮作用的重要機(jī)制之一。
　　3)植物雌激素白藜蘆醇能減輕HPH,