miR-23a參與低氧性肺動脈高壓發(fā)病機制的研究.pdf

1、長期慢性缺氧會引起肺動脈高壓，增高的肺動脈壓力導致右心功能不全。有研究報道，高原型心臟病的發(fā)病關鍵病理生理學機制也在于缺氧性肺動脈高壓（HPH）。了解HPH的發(fā)病機制是預防和治療慢性缺氧性肺部疾病導致的右心功能不全和高原型心臟病的關鍵因素之一。肺動脈高壓的主要病理學變化特點是缺氧性肺血管收縮和肺血管結構重建。肥厚的肺動脈平滑肌細胞增殖，細胞外基質(zhì)合成增加，血管平滑肌中層肥厚，肺血管重塑過程中平滑肌樣非血管性細胞的存在可能會導致肺小動脈壁

2、增厚、狹窄內(nèi)徑、肺血管阻力增加，肺動脈壓力升高。長期肺動脈高壓可能導致右心室代償性肥大甚至右心衰竭。肺動脈平滑肌細胞的異常增殖、凋亡和遷移是肺血管結構重建中最重要的病理生理學特點。既往研究往往集中在缺氧及缺氧引起的病理生理學變化及相關生物活性分子在調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和遷移等功能。最近研究結果顯示，低氧能夠明顯下調(diào)肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）收縮表型標記蛋白的表達，然而，這種具體的下調(diào)機制還不明確。因此，對PASMCs表型轉(zhuǎn)化的分子機

3、制的深入研究可以幫助我們解釋其內(nèi)在機制，包括在缺氧性肺動脈高壓過程中的肺動脈重構的機理。
　　miRNA是一類具有調(diào)節(jié)功能的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。據(jù)不完全統(tǒng)計，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)節(jié)一些正常生理過程或特定的病理和生理過程。miRNA的作用機制可以從以下兩個方面來解釋。首先,它通過直接與目標mRNA的3′-UTR非翻譯區(qū)結合降低mRNA的表達，其次,它通過不完全互補配對和抑制翻譯的過程

4、來調(diào)節(jié)miRNA的表達。幾項研究已經(jīng)表明, miRNAs參與多種生理過程,如細胞分化,新陳代謝,細胞凋亡和增殖。也參與調(diào)節(jié)許多其它的病理過程,如腫瘤發(fā)生,炎癥消退和血管增生。
　　第一部分：miR-23a影響缺氧誘導的肺動脈平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化
　　目的：探討miR-23a在缺氧誘導的肺動脈平滑肌表型轉(zhuǎn)換中的作用及低氧狀態(tài)下miR-23a的表達機制。
　　方法：膠原酶消化法提取大鼠PASMCs細胞并進行培養(yǎng)。在PASMC

5、s進行缺氧處理（3％O2）后，使用Western Blot免疫印跡法檢測培養(yǎng)細胞中SM-MHC，SMα肌動蛋白，Calponin-1，和SM22α蛋白的表達水平。缺氧條件下，使用mir-23a mimic轉(zhuǎn)染PASMCs細胞。EdU染色法檢測細胞增殖活性。
　　結果：
　　1、缺氧對大鼠PASMCs細胞的影響一般特點及不同miRNA的篩選
　　原代大鼠平滑肌細胞生長在培養(yǎng)瓶中貼壁生長，大部分細胞呈梭形，胞漿豐富，胞質(zhì)密

6、度高。細胞呈捆狀平行排列，PASMCs細胞呈峰谷分布特征。使用SM-α肌動蛋白抗體進行免疫熒光染色后，我們觀察到在細胞質(zhì)中出現(xiàn)明亮的綠色絲狀熒光。平均α-肌動蛋白陽性率水平超過95%。與常氧對照組相比，在H24h組中，miR-23a，miR-25，mir-93和miR-106的表達水平明顯增高。與常氧（N24h）組相比，miRNA表達水平明顯增加,其表達水平是常氧組的5.1倍。但miR-143和miR-145表達水平無明顯變化。觀察缺氧

7、處理48h后miR-23a表達水平發(fā)現(xiàn)，結果表明，缺氧48h后（H48h），與常氧組（N48h）相比，miR-23a表達水平升高約3.8倍。
　　2、缺氧對大鼠PASMCs收縮表型標志蛋白表達及PASMCs增殖的影響
　　在常氧對照組和缺氧處理組的肺動脈平滑肌細胞（3%O2，24h或48h）中，檢測SM-MHC，SMα肌動蛋白，Calponin-1和SM22α的表達水平。結果表明，SM-MHC，SMα肌動蛋白，Calponi

8、n-1，和SM22α的表達水平在H24h組明顯低于正常對照組（P＜0.05）。缺氧處理48h后，在PASMCs收縮表型標記蛋白明顯低于對照組（N48h）。提示，大鼠PASMCs在缺氧刺激下發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。使用EdU染色法觀測常氧及3%O2乏氧狀態(tài)下培養(yǎng)的大鼠原代PASMCs細胞的增殖活性。乏氧處理后，EdU染色48h陽性率（H48h）明顯低于常氧對照組，表明缺氧處理能顯著增強PASMCs的增殖活性。
　　3、 PASMCs細胞中，m

9、iR-23a在缺氧誘導的收縮表型標記蛋白的表達下調(diào)的作用
　　與轉(zhuǎn)染空載體miRNA的細胞相比，轉(zhuǎn)染miR-23a抑制劑后，收縮蛋白（SM-MHC，SMA肌動蛋白，Calponin-1，SM22α）表達水平明顯上調(diào)（P<0.05）。在轉(zhuǎn)染miR-23a mimic的PASMCs細胞中，檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后48h，收縮蛋白標記物表達水平明顯下調(diào)（P＜0.05）。
　　4、 miR-23a在缺氧誘導PASMCs增殖活性增強中的作用<

10、br>　　缺氧條件下，肺動脈平滑肌細胞EdU染色陽性率在vehicle和inhibitor ctrl組之間中無顯著性差異。在轉(zhuǎn)染miR-23a inhibitor的PASMCs細胞中，轉(zhuǎn)染miR-23a抑制劑后48h， EdU染色陽性率明顯減低，這一結果表明， miR-23a在促進PASMCs缺氧誘導增殖活性中具有重要的作用。在轉(zhuǎn)染mimic對照組的PASMCs細胞中， EdU染色陽性率與空白組相比，二者未見明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05

11、）。轉(zhuǎn)染miR-23a mimic48h后，與轉(zhuǎn)染mimic對照組相比，PASMCs細胞EdU染色陽性率增加（P<0.05）。這一結果表明，常氧條件下過表達miR-23a可誘導PASMCs細胞增殖明顯增加。
　　小結：缺氧狀態(tài)下，PASMCs收縮表型標記蛋白明顯降低，表明缺氧處理能顯著增強PASMCs的增殖活性。缺氧處理后，miR-23a表達水平升高，并且能夠下調(diào)收縮表型標記蛋白的水平，說明其在促進PASMCs缺氧誘導增殖活性中具

12、有重要的作用。
　　第二部分：miR-23a在缺氧肺動脈平滑肌細胞中表達上調(diào)的作用機制
　　目的：探討miR-23a在缺氧情況下表達水平上調(diào)的調(diào)控機制及其病理生理學意義。
　　方法：先在缺氧條件下使用HIF-1αsiRNA及空白對照siRNA進行PASMCs細胞轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后連續(xù)培養(yǎng)PASMCs細胞48h后，再使用RT-qPCR方法檢測PASMCs細胞中miRNA的表達水平；使用ChIP方法來驗證HIF-1α結合位點；使

13、用雙熒光素酶報告基因方法來研究HIF-1α及其結合位點的作用。
　　結果：
　　1、 HIF-1α在缺氧誘導的miRNA-23a表達上調(diào)中的調(diào)控作用
　　在缺氧條件下，使用HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染 PASMCs細胞后，miR-23a表達水平明顯減低。這一結果表明，缺氧條件下miR-23a表達上調(diào)與HIF-1α有關。在EDHB(500μM)24h(EDHB24h)組中，與對照組相比，常氧培養(yǎng)PASMCs細胞HIF-1α

14、蛋白水平和miR-23a表達水平明顯增高。pri-miR-23a-1， pri-miR-23a-2及 pri-miR-23a-3含量的變化反映出mir-23a-1，mir-23a-2，mir-23a-3轉(zhuǎn)錄活性增強。當PASMCs在缺氧條件下培養(yǎng)并使用HIF-1α特異性siRNA轉(zhuǎn)染后，pri-mir-23a-1和pri-mir-23a-3表達水平明顯降低，這一結果表明，HIF-1α參與mir-23a-1和mir-23a-3轉(zhuǎn)錄的激活作

15、用。
　　2、檢測HIF-1α與miR-23a-1和miR-23a-3的上游5KB起始區(qū)的結合情況。
　　在PASMCs細胞中，與缺氧處理前（N組）相比，缺氧24h（H24h）和48h（H48h）后，三個調(diào)節(jié)mir-23a-1非翻譯區(qū)的上游5KB預測位點（R1， R2，R3）與HIF-1α結合力明顯增強。在R1中，HIF-1α富集程度最高。與常氧對照組（N）相比，缺氧24h組(H24h)和缺氧48h組（H48h）中， miR

16、-23a-3的非翻譯區(qū)與HIF-1α結合明顯增強，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3、使用ChIP法檢測HIF-1α在mir-23a-1和mir-23a-3轉(zhuǎn)錄激活中的作用
　　為了進一步闡明缺氧對HIF-1α在miR-23a-1和miR-23a-3基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，使用野生型受體基因載體（WT）或突變（M1，M2，M3）及HIF-1α過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，在缺氧條件下（1%O2濃度）分別轉(zhuǎn)染HEK293FT細胞。結

17、果表明，使用M1，M2,M3突變載體轉(zhuǎn)染后，報告基因活性明顯下降。轉(zhuǎn)染M3的突變載體報告基因活性水平最低。缺氧可以明顯增加野生型 Luc-miR-23a-1(WT)熒光素酶活性，但對于突變型Luc-miR-23a-1M3(M3)的熒光素酶活性無明顯影響。此外，野生型和突變型報告基因載體和HIF-1α過表達質(zhì)粒及其對照載體共轉(zhuǎn)染293FT細胞。結果顯示，過表達HIF-1α可以明顯改善野生型luc-mir-23a-1熒光素酶活性（WT）（1

18、.7倍），但對luc-mir-23a-1m3突變組的熒光素酶活性沒有明顯影響（M3）。低氧條件下，干預 HIF-1α能夠顯著削弱野生型Luc-miR-23a-1（WT）熒光素酶活性增強作用。對于miR-23a-3，缺氧條件下（1%氧濃度）與HIF-1α過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染兩種情況，能分別提高野生型Luc-mir-23a-3熒光素酶活性（WT）2.8倍和1.8倍，但對luc-mir-23a-3突變沒有影響（M）。缺氧條件下干預HIF-1α在能

19、夠顯著削弱野生型Luc-mir-23a-3活性（WT）報告基因的活性。這些結果表明，缺氧可以明顯上調(diào)mir-23a-1和mir-23a-3的表達水平，這是由于HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮作用。
　　小結：缺氧條件下miR-23a表達上調(diào)與HIF-1α表達水平有關，HIF-1α可以參與mir-23a-1和mir-23a-3的轉(zhuǎn)錄激活作用。miR-23a在缺氧下表達增加主要是由于mir-23a-1和mir-23a-3上調(diào)引起。缺氧可以明顯

20、上調(diào)mir-23a-1和mir-23a-3的表達水平，這是由于HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮作用。
　　第三部分:慢性缺氧下大鼠肺中小動脈miR-23a表達水平、肺動脈平均壓、右心室重量指數(shù)及肺動脈形態(tài)學的變化
　　目的：構建大鼠肺動脈高壓模型，探討慢性缺氧狀態(tài)下肺動脈平滑肌細胞mir-23a的表達水平及低氧對大鼠肺動脈平均壓，右心室重量指數(shù)以及肺小動脈壁，內(nèi)膜中層厚度的影響。以期在動物模型中進一步闡明慢性缺氧的病理生理學意義。<

21、br>　　方法： CH組大鼠和常氧下喂養(yǎng)的對照組大鼠（NC組）分別放在模擬海拔5000米的低壓氧艙（Thermo Scientific, Waltham, MA）中喂養(yǎng)21天及正常氧壓條件下喂養(yǎng)。每組隨機選擇8只大鼠。每只大鼠腹腔注射10%烏拉坦（1ml/100g），處理后大鼠被固定到一個平臺上，分離右側(cè)頸外靜脈。每只大鼠靜脈注射肝素生理鹽水溶液（0.2ml/100g/100g體重）進行全身抗凝。自右心室進行肺動脈插管（0.45mm I

22、D和0.8mmOD），使用動力實驗室多導生理記錄儀測量大鼠平均肺動脈壓（mPAP）。處死大鼠，開胸切除心臟。將心房和結締組織仔細分離。沿室間隔游離右心室游離壁。用下列公式計算右心室重量指數(shù)：右心室重量/（左心室+室間隔）重量。
　　結果：
　　1、慢性缺氧對肺動脈平均壓（mPAP），右心室重量指數(shù)及肺小動脈壁、內(nèi)膜中層厚度的影響。
　　在慢性低氧組（CH）中，肺動脈平均壓明顯升高（P＜0.05），比對照組增加約2倍。提

23、示慢性低氧可顯著提高肺動脈壓。在慢性缺氧組大鼠（CH）中，與常氧對照組（NC）相比，RV/（LV+S）明顯增加（P＜0.05）。提示慢性缺氧可導致大鼠右心室肥厚。我們測量了血管外徑和管壁厚度（外徑-內(nèi)徑），及內(nèi)膜中層厚度。結果表明，在常氧對照組大鼠（NC）通常肺動脈壁較薄，管腔較大，外徑為81.31±2.8μm，管壁厚度為10.57±2.6μm，內(nèi)膜中層厚度為3.6±0.8μm（表1）。而在慢性缺氧組（CH）大鼠中，肺小動脈外徑為86.

24、61±6.1μm，管壁厚度為21.3±4.4μm，內(nèi)中膜厚度為8.8±1.6μm。
　　2、慢性缺氧狀態(tài)下肺小動脈miR-23a的表達水平
　　在慢性缺氧組（CH）中，與常氧對照組（NC）相比，肺小動脈miR-23a表達水平明顯增加（P＜0.05）。
　　小結：慢性缺氧可導致肺小動脈miR-23a表達水平明顯增加,并引起大鼠右心室肥厚。慢性缺氧可顯著提高肺小動脈壁的厚度，導致管壁內(nèi)側(cè)平滑肌細胞增殖及肺小動脈重構。