肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型的構(gòu)建及功能初探.pdf

1、背景:惡性腫瘤是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,而在所有的惡性腫瘤中,原發(fā)性肝癌(Hepatpocellular carcinoma,HCC)所占比例超過5％,位于惡性腫瘤總致死原因的第五位。和其他惡性腫瘤一樣,肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是其治療失敗的主要原因。
　　 在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中,EMT(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)所表現(xiàn)出的細(xì)胞學(xué)機(jī)制即細(xì)胞粘附性的喪失和遷移能力的獲得作為腫瘤轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)

2、的關(guān)鍵環(huán)節(jié)已越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。其最主要特征為上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白E-cadherin表達(dá)降低,而間質(zhì)標(biāo)記蛋白表達(dá)上調(diào)。近來,已有相當(dāng)多的證據(jù)表明,EMT是肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵事件,其在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著極其重要的作用。因此,如何動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝癌細(xì)胞的EMT事件,對(duì)進(jìn)一步剖析其機(jī)理,進(jìn)而開發(fā)針對(duì)性治療策略變得至關(guān)重要。
　　 熒光蛋白報(bào)告基因由于其異源細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定,不需要其他輔助因子參加,易于檢測(cè),無細(xì)胞毒性,且可利用不同熒光蛋

3、白組合對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多重標(biāo)記等優(yōu)勢(shì),已成為構(gòu)建指示報(bào)告系統(tǒng)的首選對(duì)象。而慢病毒載體作為目前被認(rèn)為的最有效的理想基因轉(zhuǎn)移載體之一,對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有很好的感染能力,免疫反應(yīng)小且無毒性,可以將外源基因有效地整合到宿主基因組上,從而達(dá)到穩(wěn)定持久表達(dá)等特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于基因治療、科學(xué)研究等領(lǐng)域。因而構(gòu)建基于慢病毒表達(dá)系統(tǒng)的EMT熒光指示模型具有很好的基礎(chǔ)及臨床意義。
　　 目標(biāo):構(gòu)建基于慢病毒表達(dá)系統(tǒng)的、EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cad

4、herin、Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光報(bào)告系統(tǒng),為下一步標(biāo)記示蹤肝癌EMT細(xì)胞,動(dòng)態(tài)顯示肝癌細(xì)胞的EMT過程,建立體外肝癌細(xì)胞EMT誘導(dǎo)模型打下基礎(chǔ)。
　　 方法:從Hela細(xì)胞基因組中擴(kuò)增出E-cadherin及Slug啟動(dòng)子,并分別與紅、黃、藍(lán)三種熒光蛋白相連,然后克隆入慢病毒載體質(zhì)粒中,獲得E-cadherin及Slug啟動(dòng)子分別攜帶三種熒光蛋白的慢病毒載體:Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP和Lv-pSlug-RF

5、P/YFP/BFP。采用磷酸鈣法將慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,生產(chǎn)包裝得到病毒。進(jìn)而以收獲的Lv-pE-cad-YFP病毒感染人肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5,并經(jīng)流式分選得到Y(jié)FP表達(dá)陽性和陰性的細(xì)胞,通過qRT-PCR,western blotting等技術(shù)檢測(cè)病毒的有效性。
　　 結(jié)果:經(jīng)酶切、測(cè)序等方法證實(shí)E-cadherin及Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的多熒光報(bào)告基因載體構(gòu)建成功。采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法成功包裝出病毒。