Cideb在腎小管上皮脂肪代謝中的作用.pdf

1、研究背景:
　　誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的DFF45樣效應(yīng)因子b蛋白(cell death-inducing DFF45-like effector,Cideb)是20世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的CIDE家族的重要成員,盡管最初被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡相關(guān),但后來的研究顯示出Cideb是一個重要的脂滴表面蛋白,其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴。載脂蛋白B(apolipoprotein B,apoB)是一種重要的載脂蛋白分子,是乳糜微粒(chylomicron,CM)和VLDL的

2、關(guān)鍵分子。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示Cideb能夠通過與apoB相互作用,促進(jìn)極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)的脂化過程,進(jìn)而影響中性脂肪的分泌,同時Cideb參與了肝臟的脂肪代謝過程。然而,很多研究報道了Cideb表達(dá)于腎臟,且水平較高,但是其在腎臟的具體作用尚不明確。我們推測Cideb可能參與了腎小管的脂肪重吸收過程,但其具體作用以及可能的機(jī)制尚需深入研究。
　　腎臟是一個機(jī)體物質(zhì)

3、代謝過程中的重要器官,并且很多腎臟疾病會出現(xiàn)脂質(zhì)代謝的異常。比如腎病綜合征、糖尿病腎病、尿毒癥及腎移植術(shù)后。其中,以腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)時的高脂血癥最為突出。膜性腎病時,腎小球通透性增加,從而加重了腎小管重吸收的負(fù)擔(dān),因此可作為研究腎小管重吸收功能的重要模型。本課題以Cideb敲除小鼠模型,確定Cideb缺失對腎臟脂肪含量的影響;通過膜性腎病小鼠模型和人類膜性腎病標(biāo)本,檢測Cideb表達(dá)水平在膜性腎病

4、中的變化;用過表達(dá)和沉默Cideb的細(xì)胞模型,確定Cideb對腎小管上皮細(xì)胞脂肪代謝過程的影響。本研究不僅有助于闡明Cideb在腎臟中的作用,同時對了解腎臟脂肪代謝過程也具有重要意義。
　　研究目的:
　　1)分析Cideb在腎臟中的表達(dá)水平以及分布規(guī)律,并確定Cideb敲除小鼠腎臟中脂肪含量的變化。2)檢測膜性腎病腎穿刺標(biāo)本和膜性腎病小鼠腎小管上皮細(xì)胞中Cideb表達(dá)水平,確定Cideb表達(dá)水平與腎小管重吸收功能之間的關(guān)系

5、。3)運用過表達(dá)和沉默Cideb的腎小管上皮細(xì)胞,確定Cideb在腎小管上皮脂肪重吸收和分泌中的作用,探討Cideb對腎小管上皮脂肪代謝的影響。
　　研究方法:
　　1)運用免疫組化技術(shù),確定Cideb在腎臟中的表達(dá)水平和細(xì)胞分布情況,以及與載脂蛋白apoB在腎小管中的表達(dá)情況;
　　2)通過OilRedO染色和甘油三酯(triglyceride,TG)定量分析研究Cideb敲除小鼠腎臟內(nèi)脂肪的變化,確定Cideb缺失

6、腎小管上皮細(xì)胞脂肪含量的影響;
　　3)尾靜脈注射C-BSA建立膜性腎病的動物模型,通過血尿生化分析和各種組織學(xué)方法進(jìn)行鑒定。運用免疫組化方法分析,腎病綜合征小鼠腎小管上皮中Cideb和apoB的表達(dá)水平,并通過OilRedO染色確定腎臟的脂肪含量變化;
　　4)收集膜性腎病高脂血癥患者的腎穿刺標(biāo)本,通過免疫組化分析腎小管上皮Cideb、apoB的表達(dá)水平;
　　5)通過不同濃度的棕櫚酸刺激人類近端腎小管上皮細(xì)胞系HK

7、-2細(xì)胞,通過Westernblot、Bodipy493/503染色、TG定量分析等方法確定Cideb表達(dá)水平與腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量、脂肪含量的關(guān)系;
　　6)用攜帶Cideb和CidebsiRNA的腺病毒感染HK-2細(xì)胞,建立Cideb過表達(dá)和沉默的HK-2細(xì)胞,通過Western blot、Bodipy493/503染色、TG定量分析等方法確定Cideb表達(dá)水平對腎小管上皮脂肪含量的影響;
　　7)運用Transwe

8、ll培養(yǎng)系統(tǒng)建立腎小管上皮重吸收體外模型,運用3H標(biāo)記脂肪酸,測定Cideb對脂肪吸收的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1)Cideb在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá),且Cideb敲除小鼠腎臟脂肪含量增高。
　　通過透射電鏡觀察到在小鼠的腎小管上皮細(xì)胞中有脂蛋白樣的顆粒存在;免疫組化染色結(jié)果顯示Cideb主要分布在腎小管上皮細(xì)胞中,且在近端小管中表達(dá)水平最高,而腎小球不表達(dá)Cideb。apoB在腎臟的表達(dá)情況與之類似。Oil Red

9、 O染色和TG定量分析發(fā)現(xiàn)Cideb缺失的小鼠腎臟中脂肪含量明顯增加,結(jié)果提示Cideb參與了腎臟的脂肪代謝過程。
　　2)在膜性腎病小鼠模型和膜性腎病患者中,腎小管中Cideb的表達(dá)水平明顯升高。
　　在膜性腎病時,腎小球的基底膜發(fā)生破壞,造成腎小球通透性明顯增加,從而增強了腎小管的重吸收功能,因此膜性腎病也成為研究腎小管代謝的重要模型。在本研究中,我們通過尾靜脈建立的小鼠模型和人膜性腎病的穿刺標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)Cideb和apo

10、B的表達(dá)均升高。這些結(jié)果表明,在腎小管重吸收功能增加時,腎小管上皮細(xì)胞中Cideb表達(dá)水平增加,且與apoB的升高一致,這提示Cideb與腎小管的重吸收功能有關(guān),且很可能參與了腎小管上皮細(xì)胞脂蛋白的代謝過程。
　　3)Cideb能夠抑制腎小管上皮細(xì)胞中脂肪儲積,并促進(jìn)脂肪的分泌過程。
　　用不同濃度棕櫚酸促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)脂肪的儲積,結(jié)果顯示能夠提高細(xì)胞內(nèi)Cideb表達(dá)水平。同時,運用腺病毒在HK-2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)Cideb

11、,用顯示脂滴的Bodipy493/503染色,結(jié)果顯示Cideb過表達(dá)能夠降低細(xì)胞內(nèi)TG的含量,減少胞漿內(nèi)脂滴數(shù)量。然而,沉默Cideb可以顯著提高細(xì)胞內(nèi)TG的含量,增加細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量增加。進(jìn)一步,運用Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)建立腎小管上皮重吸收體外模型,3H標(biāo)記的脂肪酸測定腎小管上皮分泌脂蛋白的情況。結(jié)果顯示,過表達(dá)Cideb能夠抑制HK-2細(xì)胞內(nèi)脂肪儲積速度,促進(jìn)HK-2細(xì)胞脂肪的分泌速度;抑制Cideb能夠造成細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)儲積,并

12、抑制HK-2細(xì)胞的分泌過程。結(jié)果提示,Cideb能夠促進(jìn)腎小管上皮脂肪的分泌過程。
　　結(jié)論:
　　本研究首先確定了Cideb主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞,且在腎近曲小管上皮細(xì)胞中表達(dá)水平最高,且與apoB表達(dá)水平和腎小管重吸收功能一致;而Cideb缺失小鼠腎小管上皮細(xì)胞中脂肪含量明顯增加。由于膜性腎病時腎小球通透性明顯增加,因此我們在建立膜性腎病小鼠模型基礎(chǔ)上,加上膜性腎病患者的穿刺標(biāo)本,分析Cideb表達(dá)水平與膜性腎病之間的

13、關(guān)系,結(jié)果顯示Cideb在膜性腎病的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)水平明顯升高,并與apoB升高一致。為了進(jìn)一步確定Cideb在腎小管上皮細(xì)胞中的具體作用和機(jī)制,我們運用過表達(dá)和沉默Cideb的腺病毒感染HK-2細(xì)胞,結(jié)果顯示過表達(dá)Cideb能夠抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)儲積,并促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)的分泌;相反沉默Cideb能夠造成細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的儲積,而降低細(xì)胞TG的分泌速度。
　　綜上所述,本研究首次確定了Cideb主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞,并可能與