腎小管上皮細(xì)胞在CCL20招募Th17過程中的作用.pdf

1、背景：
　　Th17作為新發(fā)現(xiàn)的一類輔助性T細(xì)胞亞群，不僅作用于清除胞外病原體，而且參與自身免疫及炎性疾病，其效應(yīng)主要通過產(chǎn)生IL-17實(shí)現(xiàn)。Th17高表達(dá)趨化因子受體CCR6，與其唯一的高特異性配體CCL20趨化因子成對(duì)，介導(dǎo)了Th17的募集。研究發(fā)現(xiàn)，腎臟組織中CCL20主要由腎小管間質(zhì)的浸潤細(xì)胞以及腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生。此外有文獻(xiàn)報(bào)道IL-17可刺激氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生CCL20。因此，本研究推測(cè):IL-17作為一種炎癥介質(zhì)可能刺

2、激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子CCL20，從而提示腎小管上皮細(xì)胞除履行自身非免疫細(xì)胞功能外，在炎癥狀態(tài)下尚具備招募Th17的潛能。
　　目的：
　　本研究擬探討IL-17作為一種炎癥介質(zhì)是否可以刺激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子CCL20。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　用完全培養(yǎng)基（10％胎牛血清、1％青霉素和鏈霉素的1∶1DMEM/F12培養(yǎng)液）常規(guī)培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）。
　　2.免疫細(xì)

3、胞化學(xué)
　　HK-2爬片經(jīng)處理后以特異性一抗(E-cad，CK-18)孵育，對(duì)照組使用PBS代替一抗，后經(jīng)二抗作用，DAB顯色。
　　3.IL-17處理
　　隨機(jī)分組，用梯度濃度(0，1，10，100ng/mL)的IL-17刺激HK-2，以研究劑量效應(yīng)關(guān)系，分別于24h收樣行RT-PCR檢測(cè)，48h收樣行ELISA檢測(cè);隨機(jī)分組，以10ng/mL IL-17刺激HK-2于不同時(shí)間(6，12，24，48h)終止處理，以研

4、究時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。
　　4.RT-PCR分析
　　用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行分析。mRNA相對(duì)表達(dá)量通過2-△△C表示。每組實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次。
　　5.ELISA檢測(cè)
　　用ELISA檢測(cè)CCL20的分泌，得到OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程以計(jì)算CCL20濃度。每組實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次。
　　6.統(tǒng)計(jì)分析
　　所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理

5、。經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素ANOVA用于判定顯著性差異，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組相比，E-cad和CK18在HK-2細(xì)胞中表達(dá)陽性。
　　2.與對(duì)照組相比，IL-17顯著促進(jìn)CCL20的mRNA表達(dá)和蛋白分泌(P＜0.05)，并且呈劑量和時(shí)間依賴性。
　　結(jié)論：
　　IL-17作為一種炎癥介質(zhì)可刺激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子CCL20，從而提示腎小管上皮細(xì)胞