補(bǔ)體應(yīng)答基因RGC-32對(duì)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的調(diào)控研究.pdf

1、研究目的:
　　1.觀察RGC-32在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化以及巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中的表達(dá)，探討調(diào)控巨噬細(xì)胞RGC-32表達(dá)的因素。
　　2.觀察RGC-32表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞分泌IL-6、TGF-β、IL-1β和TNF-α等炎癥因子的影響，探討RGC-32調(diào)控巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.以單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象，分別在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測(cè)THP-1細(xì)胞在向巨噬細(xì)胞分化及巨噬

2、細(xì)胞極化過(guò)程中RGC-32的表達(dá)
　　THP-1細(xì)胞在含有100ng/ml的PMA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，48小時(shí)后誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞。THP-1細(xì)胞在含100ng/ml的PMA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)6小時(shí)，然后加入100ng/ml的LPS和20ng/ml的IFN-γ或20ng/ml的IL-4培養(yǎng)42小時(shí)后，分別極化為M1型或M2型THP-1巨噬細(xì)胞。在單核細(xì)胞系向THP-1巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的第0、6、12、24和48小時(shí)，分別采用熒光定量PCR和w

3、estern-blot檢測(cè)RGC-32在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。取THP-1細(xì)胞和THP-1巨噬細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，采用熒光顯微鏡觀察RGC-32在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)和定位。提取THP-1巨噬細(xì)胞、M1和M2型THP-1巨噬細(xì)胞的總RNA和蛋白，分別采用熒光定量PCR和western-blot檢測(cè)RGC-32在THP-1巨噬細(xì)胞、M1和M2型THP-1巨噬細(xì)胞的表達(dá)。
　　2.人CD14+細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，探討單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化及巨

4、噬細(xì)胞極化過(guò)程中RGC-32的表達(dá)
　　取健康志愿者的外周血、結(jié)腸癌患者的外周血和腹水，密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，采用CD14+磁珠陽(yáng)性篩選獲得外周血單核細(xì)胞或CD14+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages，TAMs)。純化后的外周血單核細(xì)胞在含有100ng/ml的M-CSF和10％胎牛血清的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)7天分化為巨噬細(xì)胞，加入LPS和IFN-γ繼續(xù)培養(yǎng)2天，極化為M1型巨噬細(xì)胞

5、，而巨噬細(xì)胞加入IL-4繼續(xù)培養(yǎng)2天，極化為M2型巨噬細(xì)胞。采用熒光定量PCR法檢測(cè)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化及巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中RGC-32 mRNA的表達(dá)水平。
　　3.以單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象，探討在巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中調(diào)控RGC-32的因子
　　分別采用標(biāo)準(zhǔn)濃度的LPS配合梯度濃度的IFN-γ或標(biāo)準(zhǔn)濃度的IFN-γ配合梯度濃度的LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞系極化為M1型THP-1巨噬細(xì)胞，采用梯度濃度的IL-4誘導(dǎo)

6、THP-1細(xì)胞極化為M2型THP-1巨噬細(xì)胞，熒光定量PCR法檢測(cè)RGC-32 mRNA的表達(dá)水平，以確定在巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中LPS、IFN-γ和IL-4對(duì)RGC-32表達(dá)的影響。
　　4.以單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象，采用siRNA和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默和過(guò)表達(dá)THP-1細(xì)胞中RGC-32
　　以HiPerFect Transfection為載體轉(zhuǎn)染siRNA干擾THP-1細(xì)胞中RGC-32的表達(dá)。取THP-1細(xì)

7、胞經(jīng)PBS洗滌后，加入無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為陰性載體對(duì)照組1、陰性載體對(duì)照組2和干擾組，分別加入HiPerFect Transfection、陰性對(duì)照siRNA和RGC-32siRNA，孵育12小時(shí)后，加入100ng/ml的PMA，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，提取總蛋白，用western-blot檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中RGC-32蛋白的表達(dá)水平，計(jì)算RGC-32的沉默效率。
　　逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞過(guò)表達(dá)R

8、GC-32。取THP-1細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，將含有pBMN-GFP和pBMN-GFP-RGC-32上清液加入至THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染THP-1細(xì)胞。感染THP-1細(xì)胞后經(jīng)100ng/ml的PMA處理48小時(shí)，收集細(xì)胞并提取總蛋白，用western-blot檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中RGC-32蛋白的表達(dá)水平。
　　5.RGC-32沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)和分泌的影響
　　PMA誘導(dǎo)沉默和過(guò)表達(dá)R

9、GC-32的THP-1細(xì)胞48小時(shí)后分化為巨噬細(xì)胞，收集細(xì)胞并提取總RNA，用熒光定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β mRNA的表達(dá)水平。分化的巨噬細(xì)胞用PBS洗3次，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，高速離心后采用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的濃度。
　　6.探討RGC-32調(diào)控巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-6的分子機(jī)制
　　采用P13K抑制劑L

10、Y294002或?qū)φ誅MSO預(yù)處理siRGC-32和siRNA的THP-1細(xì)胞60min，PBS洗滌后，采用PMA刺激48小時(shí)誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞。PBS洗3次，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，高速離心后采用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的分泌水平。分別收集siRGC-32和siRNA的巨噬細(xì)胞提取總蛋白后，采用western-blot技術(shù)檢測(cè)AKT磷酸化蛋白水平。
　　結(jié)果:

11、　　1.RGC-32在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中呈誘導(dǎo)性表達(dá)，巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中RGC-32表達(dá)下調(diào)，向M2型極化過(guò)程中表達(dá)上調(diào)
　　熒光定量PCR和western-blot結(jié)果顯示，THP-1細(xì)胞向THP-1巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中，RGC-32呈誘導(dǎo)性表達(dá)。免疫熒光檢測(cè)顯示，RGC-32表達(dá)于THP-1細(xì)胞和THP-1巨噬細(xì)胞的細(xì)胞漿，且RGC-32在THP-1巨噬細(xì)胞表達(dá)的熒光強(qiáng)度明顯高于THP-1細(xì)胞。THP-

12、1巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS和IFN-γ刺激極化為M1型THP-1巨噬細(xì)胞，RGC-32的表達(dá)顯著地降低。而巨噬細(xì)胞經(jīng)IL-4刺激極化為M2型THP-1巨噬細(xì)胞，RGC-32的表達(dá)上調(diào)。人單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化及巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中RGC-32的表達(dá)趨勢(shì)與單核細(xì)胞系一致。
　　2.在M1型巨噬細(xì)胞中，LPS抑制RGC-32表達(dá)，而在M2型巨噬細(xì)胞中I L-4促進(jìn)RGC-32的表達(dá)
　　采用濃度梯度的IFN-γ與標(biāo)準(zhǔn)的LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向

13、M1極化，結(jié)果顯示RGC-32mRNA的表達(dá)水平在各組之間無(wú)顯著差異。采用濃度梯度的LPS與標(biāo)準(zhǔn)的IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化，隨著LPS濃度的增高，RGC-32 mRNA的表達(dá)水平逐漸降低。利用濃度梯度的IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2極化，結(jié)果顯示隨著IL-4濃度的升高，RGC-32 mRNA的表達(dá)水平逐漸增高。
　　3.在TAMs中RGC-32的表達(dá)受腫瘤微環(huán)境中M-GSF和IL-4所調(diào)控
　　TAMs起源于外周血單核細(xì)胞，被

14、腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞募集到腫瘤部位。磁珠分選分離轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌腹水中CD14+ TAMs，采用熒光定量PCR檢測(cè)RGC-32在TAMs中的表達(dá)較單核細(xì)胞明顯增高。這提示由腫瘤釋放的細(xì)胞因子可能參與上調(diào)RGC-32表達(dá)。我們應(yīng)用M-CSF和IL-4特異性抗體封閉轉(zhuǎn)移性腹水中M-CSF和IL-4，然后將封閉后腹水加入到單核細(xì)胞培養(yǎng)體系中，結(jié)果顯示RGC-32的表達(dá)明顯降低。
　　4.以HiPerFect Transfection為載體轉(zhuǎn)染

15、siRNA干擾或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染能有效地沉默或過(guò)表達(dá)THP-1巨噬細(xì)胞中RGC-32的表達(dá)
　　以HiPerFect Transfection為載體轉(zhuǎn)染siRNA干擾THP-1細(xì)胞，然后誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，檢測(cè)干擾RGC-32表達(dá)效率。結(jié)果顯示，siRGC-32能有效干擾巨噬細(xì)胞RGC-32蛋白的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染THP-1細(xì)胞，誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，采用western-blot檢測(cè)RGC-32過(guò)表達(dá)的效

16、率。結(jié)果顯示，在巨噬細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄病毒感染能有效地過(guò)表達(dá)RGC-32。
　　5.RGC-32可抑制巨噬細(xì)胞分泌IL-6，促進(jìn)TGF-β的產(chǎn)生
　　siRGC-32及對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA和收集培養(yǎng)上清，分別采用熒光定量PCR和ELISA檢測(cè)巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-6、TGF-β、IL-1β和TNF-α的水平。結(jié)果顯示，RGC-32干擾可促進(jìn)巨噬細(xì)胞IL-6，抑制TGF-β的表達(dá)和分泌，但不影響IL-1β和

17、TNF-α的表達(dá)和分泌。提取過(guò)表達(dá)RGC-32的巨噬細(xì)胞及對(duì)照巨噬細(xì)胞總RNA和收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，結(jié)果顯示RGC-32的表達(dá)可抑制巨噬細(xì)胞IL-6，促進(jìn)TGF-β的表達(dá)和分泌，但不影響IL-1β和TNF-α。
　　6.RGC-32通過(guò)抑制PI-3K信號(hào)通路從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞IL-6的分泌
　　PI-3K信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)IL-6的分泌。分別在0、12、24和48小時(shí)收集PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞，提取總蛋白，western-bl

18、ot檢測(cè)到磷酸化的AKT顯著增加，48小時(shí)后達(dá)到峰值，而總AKT沒(méi)有變化。采用LY294002預(yù)處理THP-1細(xì)胞，PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為T(mén)HP-1巨噬細(xì)胞，ELISA檢測(cè)LY294002顯著地抑制巨噬細(xì)胞分泌IL-6，對(duì)巨噬細(xì)胞分泌TGF-β無(wú)顯著影響。分別比較LY294002預(yù)處理siRGC-32和對(duì)照siRNA的巨噬細(xì)胞，兩者分泌IL-6的水平無(wú)顯著差異。除此之外，western-blot檢測(cè)到siRGC-32的巨噬細(xì)胞A