PTEN干擾促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá).pdf

1、目的：
　　觀察轉(zhuǎn)染PTEN干擾RNA（PTEN siRNA）對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（NR8383）腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá)的影響，探討PTEN對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)NR8383，將細(xì)胞分成兩組：對(duì)照組轉(zhuǎn)染Control siRNA，干擾組轉(zhuǎn)染PTEN s

2、iRNA，分別選取10nM、20nM、40nM濃度轉(zhuǎn)染24小時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Real time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞中PTEN mRNA表達(dá)，采用蛋白質(zhì)印跡法（western blot）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，選擇20nM為最

3、佳實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染濃度。
　　2.將NR8383細(xì)胞分成兩組：對(duì)照組轉(zhuǎn)染Control siRNA，干擾組轉(zhuǎn)染PTEN siRNA，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，兩組細(xì)胞分別用終濃度1μg/ml LPS刺激細(xì)胞6小時(shí)，采用RT-qPCR檢測(cè)兩組細(xì)胞內(nèi)TNF-αmRNA表達(dá)，采用western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞內(nèi)AKT磷酸化水平，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清

4、液中TNF-α蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組比較，10nM、20nM和40nM干擾組PTEN mRNA表達(dá)分別下調(diào)至（0.33±0.01）倍（P<0.01）、（0.23±0.01）倍（P<0.01）、（0.21±0.01）倍（P<0.01）；PTEN蛋白表達(dá)分別下降至（0.30±0.03）倍（P<0.01）、（0.14±0.02）倍（P<0.01）、（0.10±0.02）倍（P<0.01）；在干擾組中，與10

5、nM濃度比較，20nM、40nM濃度PTEN蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。20nM與40nM濃度比較，PTEN蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.08）。
　　2.兩組細(xì)胞LPS刺激6小時(shí)后，與對(duì)照組比較，p-AKT/AKT蛋白比值從（0.26±0.02）表達(dá)上升至（0.52±0.03）倍（P<0.01），干擾組細(xì)胞中TNF-αmRNA表達(dá)上調(diào)至（1.56±0.18）倍（P<0.01）。Control siRNA+LPS對(duì)照