抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體和單克隆抗體在原發(fā)性肝癌診斷和治療上應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體和單克隆抗體在原發(fā)性肝癌診斷和治療上應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究姓名：楊道鋒申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：內(nèi)科傳染病學(xué)指導(dǎo)教師：田德英20030401華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文用Ncol和Not工酶切后亞克隆到帶Hiscmyc標(biāo)記的原核分泌型表達(dá)載體PUC19119上，轉(zhuǎn)化TG1大腸桿菌，用菌落PCR篩選陽性菌落，工PTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDSPAGE鑒定其分子量，以表達(dá)人TfR的細(xì)胞SMMC7721作抗原，

2、表達(dá)的scFv作一抗，抗HisMcAb作二抗，用間接免疫熒光法鑒定其抗體活性。3抗TtRscFv堿性磷酸酶融合蛋白的制備用Sfi工和Notl分別酶切scFv表達(dá)質(zhì)粒pSAb，獲得scFv基因，直接亞克隆到堿性磷酸酶(alkalinephosphataseAP)融合蛋白表達(dá)載體pDAP2中，轉(zhuǎn)化TGI大腸桿菌，用菌落PCR篩選陽性菌落，1PTG誘導(dǎo)scFvAP融合蛋白的表達(dá)。4.抗TfRscFvAP融合蛋白的鑒定及性質(zhì)分析SDSPAGE鑒

3、定其分子量，以表達(dá)人TfR的細(xì)胞SMMC了721作抗原，scFvAP融合蛋白作一抗，免疫組化法鑒定其抗體和酶活性。結(jié)果重疊延伸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約700bpeSDSPAGE證明陽性菌經(jīng)工PTG誘導(dǎo)后表達(dá)一27KD左右的蛋白質(zhì)，間接免疫熒光證明表達(dá)產(chǎn)物有抗人TfR的活性。SDSPAGE證實(shí)scFvAP融合蛋白分子量約為75KD，直接證明scFvAP融合蛋白具有結(jié)合人TfR和AP活性的雙重功效。本研究成功地構(gòu)建并表達(dá)了抗人TfRscFv及其sc

4、FvAP融合蛋白，為抗人TfRscFv的應(yīng)用提供了初步的前期研究基礎(chǔ)。第二部分TfR介導(dǎo)的自殺基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立及其體外抗瘤效應(yīng)本研究從目的基因轉(zhuǎn)移靶向性和目的基因表達(dá)特異性入手，設(shè)計(jì)了雙定位介導(dǎo)組織特異性高效酶解前藥系統(tǒng)，即首先利用antiTfRMcAb結(jié)合到高表達(dá)TfR的腫瘤細(xì)胞表面，通過受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用使外源目的基因進(jìn)入靶細(xì)胞實(shí)現(xiàn)一次定位:再在甲胎蛋白〔alphafetoproteinAFP)啟動(dòng)子的特異性調(diào)控下僅在肝癌細(xì)胞中表達(dá)