抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體的制備及其性質(zhì)的初步研究.pdf

1、目的及意義：以純化的人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）蛋白為免疫原，建立能分泌抗人TfR單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞株，并制備純化單抗。期望所研制的抗體為人肝癌中TfR的表達(dá)、生物學(xué)功能研究以及為以TfR為靶點(diǎn)的腫瘤的靶向治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　內(nèi)容、方法及結(jié)果：
　　1.HepG2細(xì)胞中TfR表達(dá)的鑒定：通過RT-PCR、Western Blot方法均證實(shí)了TfR在HepG2細(xì)胞中高表達(dá)，用免疫熒光方法對(duì)HepG2細(xì)胞中TfR進(jìn)行定位

2、分析，表明TfR在細(xì)胞膜表面及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)。
　　2.TfR的提取與純化：提取HepG2細(xì)胞總蛋白，用親和層析柱分離純化TfR蛋白，再用50kd Millipore超濾管將蛋白濃縮脫鹽。通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)證實(shí)純化樣品確為TfR蛋白。
　　3.TfR免疫BALB/C小鼠及細(xì)胞株的建立：用純化的TfR抗原對(duì)Balb/C小鼠進(jìn)行3次免疫后，通過間接ELISA方法檢測(cè)免疫小鼠抗體效價(jià)，選取效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。采

3、用聚乙二醇法將免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的細(xì)胞融合，通過HAT選擇培養(yǎng)基和間接ELISA法初篩出20個(gè)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞孔，采用Cell-ELISA法進(jìn)一步篩選培養(yǎng)上清，其中B6、E8兩個(gè)孔培養(yǎng)上清與HepG2細(xì)胞結(jié)合陽(yáng)性，其中B6培養(yǎng)上清陽(yáng)性反應(yīng)最強(qiáng)，將其擴(kuò)大培養(yǎng)并用有限稀釋克隆法進(jìn)行克隆化處理，通過Cell-ELISA法檢測(cè)克隆細(xì)胞上清，細(xì)胞克隆陽(yáng)性率為100％。將此細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。
　　4.小鼠腹水抗體的制備：將分

4、泌TfR特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，注射入石蠟油致敏的Balb/C小鼠腹腔，收集腹水，用間接ELISA法檢測(cè)腹水抗體效價(jià)可達(dá)1:20000。
　　5.雜交瘤細(xì)胞染色分析：采用秋水仙素法，得到雜交瘤細(xì)胞的染色體為58±2對(duì)，由于雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，一部分染色體會(huì)丟失，實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，證明細(xì)胞融合成功。
　　6.單克隆抗體免疫學(xué)性質(zhì)鑒定：
　?、倜庖邿晒馊旧ㄨb定：免疫熒光結(jié)果顯示TfR單抗能與HepG