抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體的制備及其性質(zhì)的初步研究.pdf

1、目的及意義：以純化的人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）蛋白為免疫原，建立能分泌抗人TfR單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞株，并制備純化單抗。期望所研制的抗體為人肝癌中TfR的表達、生物學(xué)功能研究以及為以TfR為靶點的腫瘤的靶向治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　內(nèi)容、方法及結(jié)果：
　　1.HepG2細胞中TfR表達的鑒定：通過RT-PCR、Western Blot方法均證實了TfR在HepG2細胞中高表達，用免疫熒光方法對HepG2細胞中TfR進行定位

2、分析，表明TfR在細胞膜表面及細胞質(zhì)內(nèi)均有表達。
　　2.TfR的提取與純化：提取HepG2細胞總蛋白，用親和層析柱分離純化TfR蛋白，再用50kd Millipore超濾管將蛋白濃縮脫鹽。通過SDS-PAGE電泳檢測證實純化樣品確為TfR蛋白。
　　3.TfR免疫BALB/C小鼠及細胞株的建立：用純化的TfR抗原對Balb/C小鼠進行3次免疫后，通過間接ELISA方法檢測免疫小鼠抗體效價，選取效價最高的小鼠進行加強免疫。采

3、用聚乙二醇法將免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0的細胞融合，通過HAT選擇培養(yǎng)基和間接ELISA法初篩出20個陽性雜交瘤細胞孔，采用Cell-ELISA法進一步篩選培養(yǎng)上清，其中B6、E8兩個孔培養(yǎng)上清與HepG2細胞結(jié)合陽性，其中B6培養(yǎng)上清陽性反應(yīng)最強，將其擴大培養(yǎng)并用有限稀釋克隆法進行克隆化處理，通過Cell-ELISA法檢測克隆細胞上清，細胞克隆陽性率為100％。將此細胞擴大培養(yǎng)并凍存。
　　4.小鼠腹水抗體的制備：將分

4、泌TfR特異性抗體的雜交瘤細胞，注射入石蠟油致敏的Balb/C小鼠腹腔，收集腹水，用間接ELISA法檢測腹水抗體效價可達1:20000。
　　5.雜交瘤細胞染色分析：采用秋水仙素法，得到雜交瘤細胞的染色體為58±2對，由于雜交瘤細胞不穩(wěn)定，一部分染色體會丟失，實驗結(jié)果接近兩種親本細胞染色體數(shù)目的總和，證明細胞融合成功。
　　6.單克隆抗體免疫學(xué)性質(zhì)鑒定：
　?、倜庖邿晒馊旧ㄨb定：免疫熒光結(jié)果顯示TfR單抗能與HepG