抗人肝腸鈣黏附蛋白(CDH17)單克隆抗體治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分
　　抗人肝腸鈣黏附蛋白(CDHl7)單克隆抗體的制備、純化及鑒定
　　目的:
　　培育Lic5及Lic3雜交瘤細(xì)胞,通過(guò)小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞的方法制備純化抗人肝腸鈣黏附蛋白(CDH17)單克隆抗體Lic5及Lic3,用以研究以人CDH17為靶點(diǎn)的單克隆抗體的體內(nèi)外抗腫瘤作用。
　　方法:
　　將Lic5及Lic3雜交瘤細(xì)胞注射入BALB/cnu/nu小鼠腹腔,收集含有單克隆抗體的腹水。使用Pro

2、teinA親和層析法純化單克隆抗體,WesternBlot鑒定單克隆抗體的特異性,銀染色法鑒定單克隆抗體的純度,改良Lowry法測(cè)定抗體濃度。
　　結(jié)果:
　　1.Lic5及Lic3雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好,活力高。裸鼠腹腔注射Lic5雜交瘤7-10天即可收集腹水,平均產(chǎn)量7.25ml/只裸鼠,注射Lic3雜交瘤第15天可收集腹水,平均產(chǎn)量5.5ml/只裸鼠。
　　2.Lic5及Lic3銀染色在50kD和25kD處各見(jiàn)清晰獨(dú)

3、立條帶,分別為單克隆抗體的重鏈和輕鏈位置,無(wú)明顯雜帶。WesternBlot測(cè)定MHCC97L及AGS細(xì)胞裂解液CDH17表達(dá),在120kD處可見(jiàn)到單一條帶,無(wú)明顯雜帶。通過(guò)亞型試紙鑒定,Lic5及Lic3單克隆抗體分別為IgG2b、IgG2a。
　　3.Lic5雜交瘤腹水中單克隆抗體含量為2.75mg/ml,Lic3雜交瘤腹水中單克隆抗體含量11.8mg/ml。
　　結(jié)論
　　1.通過(guò)雜交瘤腹水種植法獲得高產(chǎn)量、高效

4、價(jià)的抗CDH17單克隆抗體腹水。
　　2.成功制備了高產(chǎn)量、高純度、高特異度的抗人CDH17單克隆抗體Lic5及Lic3。
　　3.ProteinA親和層析法適合于實(shí)驗(yàn)室用單克隆抗體的純化。
　　第二部分
　　抗人肝腸鈣黏附蛋白(CDH17)單克隆抗體對(duì)人肝癌細(xì)胞株的生物學(xué)屬性的影響
　　目的:
　　研究抗CDH17單克隆抗體Lic5及Lic3對(duì)CDH17不同表達(dá)水平的人肝癌細(xì)胞株MHCC97L,MH

5、CC97H,PLC/PRF/5及永生型人肝細(xì)胞株MIHA的增殖、遷移、侵襲、克隆形成及對(duì)針對(duì)性化療藥物敏感性的變化,探討其作用機(jī)制。
　　方法:
　　用WesternBlot及qPCR方法檢測(cè)四種細(xì)胞株MHCC97L,MHCC97H,PLC/PRF/5及MIHA的CDH17表達(dá)水平;細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)單克隆抗體Lic5及Lic3與活細(xì)胞膜上的CDH17的結(jié)合能力。以PBS和小鼠IgG為對(duì)照,MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力;細(xì)胞劃

6、痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力;Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力;平板法檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力;MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性變化;WesternBlot進(jìn)行相關(guān)信號(hào)通路的初步探討。
　　結(jié)果:
　　1.CDH17在人肝癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MHCC971、MHCC97H中明顯高表達(dá),而在人肝癌原位細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5及永生型人肝細(xì)胞株MIHA中檢測(cè)不到蛋白水平表達(dá),mRNA水平明顯低表達(dá)。
　　2.免疫熒光染色顯示

7、MHCC97L及MHCC97H細(xì)胞在單克隆抗體Lic5及Lic3組可以見(jiàn)到細(xì)胞膜強(qiáng)熒光染色,而在PLC/PRF/5和MIHA細(xì)胞株未見(jiàn)細(xì)胞膜熒光染色。
　　3.MHCC97L及MHCC97H細(xì)胞的增殖能力在單克隆抗體Lic5及Lic3組明顯減弱,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05),而PLC/PRF/5及MIHA細(xì)胞增殖能力在各組無(wú)差異。
　　4.MHCC97L及MHCC97H細(xì)胞的遷移能力在單克隆抗體Lic5及Lic3

8、組明顯減弱,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05),而PLC/PRF/5及MIHA細(xì)胞在各組遷移能力無(wú)差異。
　　5.MHCC97L及M11CC97H細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)在單克隆抗體Lic5及Lic3組明顯減少,MHCC97L穿膜細(xì)胞抑制率分別是78.9％和71.1％,MHCC97H穿膜細(xì)胞抑制率分別是67.3％和60.9％,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01),而PLC/PRF/5及MIHA細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)在各組無(wú)明顯差異。

9、r>　　6.MHCC97L及MHCC97H細(xì)胞的平板克隆形成數(shù)在單克隆抗體Lic5及Lic3組明顯減少,MHCC97L平板克隆形成抑制率分別是53％和48.6％,MHCC97H平板克隆抑制率分別是60.5％和56.3％,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01),而PLC/PRF/5及MIHA細(xì)胞平板克隆細(xì)胞數(shù)在各組均無(wú)明顯差異。
　　7.MHCC97L及MHCC97H細(xì)胞對(duì)順鉑(Cisplatin)的敏感性檢測(cè),單克隆抗體Lic5

10、及Lic3組細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05),而對(duì)PLC/PRF/5及MIHA細(xì)胞敏感性無(wú)明顯影響。
　　8.Lic5及Lic3單克隆抗體可以下調(diào)MHCC97L及MHCC97H細(xì)胞的CDH17蛋白表達(dá),對(duì)mRNA表達(dá)水平無(wú)影響。
　　9.MHCC97L及MHCC97H細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin在Lic5及Lic3單克隆抗體組表達(dá)水平明顯降低。

11、r>　　結(jié)論:
　　1.Lic5及Lic3單克隆抗體可以和MHCC97L及MHCC97H活細(xì)胞細(xì)胞膜上的CDH17結(jié)合。
　　2.與PBS空白對(duì)照組及小鼠IgG平行對(duì)照組相比,Lic5及Lic3單克隆抗體明顯改變MHCC97L及MHCC97H細(xì)胞生物學(xué)屬性,表現(xiàn)為增殖遲緩,遷移、侵襲能力減退,平板克隆能力減弱。
　　3.Lic5及Lic3單克隆抗體明顯提高M(jìn)HCC97L及MHCC97H細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。
　　4

12、.Lie5及Lic3單克隆抗體可以下調(diào)MHCC97L及MHCC97H細(xì)胞的CDH17及β-catenin蛋白表達(dá)。
　　第三部分
　　抗人肝腸鈣黏附蛋白(CDH17)單克隆抗體及聯(lián)合順鉑(Cisplatin)靶向治療對(duì)活體肝癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的抑制作用及相關(guān)信號(hào)通路的初步探討
　　目的:
　　研究抗人CDH17單克隆抗體Lic5及Lic3及聯(lián)合順鉑(Cisplatin)對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC97L皮下移植瘤及原位移植瘤的

13、抗腫瘤作用,探討相關(guān)信號(hào)通路的改變。
　　方法:
　　用人肝癌細(xì)胞株MHCC97L分別建立皮下移植瘤模型和原位移植瘤模型。將皮下移植瘤模型裸鼠分為六組,分別是PBS空白對(duì)照組,小鼠IgG平行對(duì)照組,Lic5低劑量組(2.5mg/kg),Lic5高劑量組(5mg/kg),順鉑單藥治療組(1mg/kg),Lic5聯(lián)合順鉑治療組(Lic55mg/kg,順鉑1mg/kg),觀察Lic5單克隆抗體及聯(lián)合順鉑對(duì)皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響。用W

14、esternBlot及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)人肝癌皮下荷瘤鼠單克隆抗體治療后腫瘤組織內(nèi)CDH17表達(dá)變化及相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)變化。將原位移植瘤模型裸鼠分為四組,PBS空白對(duì)照組,小鼠IgG平行對(duì)照組,Lic5低劑量組(2.5mg/kg),Lic5高劑量組(5mg/kg),使用生物發(fā)光監(jiān)測(cè)不同處理組腫瘤生長(zhǎng)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.在MHCC97L皮下移植瘤模型中,與PBS空白對(duì)照組及小鼠IgG平行對(duì)照組比較,Lic

15、5高低劑量組及聯(lián)合順鉑治療組皮下瘤均生長(zhǎng)緩慢,以Lic5聯(lián)合順鉑治療組腫瘤生長(zhǎng)最慢,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((p＜0.05)。Lic5聯(lián)合順鉑組腫瘤生長(zhǎng)較順鉑單用組明顯變慢,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　2.在MHCC97L皮下移植瘤模型中,Lic5低劑量組(2.5mg/kg)肺轉(zhuǎn)移率50％,高劑量組(5mg/kg)33％,Lic5與順鉑聯(lián)合組0％,而PBS空白對(duì)照組及小鼠IgG平對(duì)照組均為83.3％。
　　3.在M

16、HCC97L皮下移植瘤模型中,Lic5高低劑量組及聯(lián)合順鉑治療組腫瘤組織內(nèi)Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯減少,與PBS空白對(duì)照組及小鼠IgG平行對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。
　　4.在MHCC97L皮下移植瘤模型中,WesternBlot及免疫組化染色均顯示Lic5高低劑量組及聯(lián)合順鉑治療組腫瘤組織中CDH17表達(dá)減少,以Lic5高劑量組及聯(lián)合順鉑組顯著。在CDH17下調(diào)同時(shí),也檢測(cè)到Wnt/β-catenin信號(hào)

17、通路中關(guān)鍵分子β-catenin、CyclinD1表達(dá)均減少,而Rb表達(dá)相應(yīng)增加。
　　5.在EBCC97L皮下移植瘤模型中,H&E染色顯示Lic5高低劑量組及聯(lián)合順鉑治療組裸鼠肝、腎、肺、脾等重要器官未發(fā)現(xiàn)明顯組織結(jié)構(gòu)異常。
　　6.在MHCC97L原位移植瘤模型中,與PBS空白對(duì)照組及小鼠IgG平行對(duì)照組比較,Lic5高低劑量治療組生物發(fā)光信號(hào)均減弱,原位腫瘤體積明顯小于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。在PB

18、S組及小鼠IgG對(duì)照組,肺轉(zhuǎn)移率100％,在Lic5低劑量組(2.5mg/kg),肺轉(zhuǎn)移率50％,在Lic5高劑量組(5mg/kg),肺轉(zhuǎn)移率33.3％。結(jié)果與MHCC97L皮下移植瘤治療結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　1.抗人CDH17單克隆抗體Lic5能夠顯著抑制MHCC97L裸鼠皮下移植瘤及原位移植瘤的生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移,為肝癌的分子靶向治療提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　2.抗人CDH17單克隆抗體Lic5通過(guò)下調(diào)MHCC9