BAG-1—GR信號(hào)通路調(diào)控糖皮質(zhì)激素抗炎效應(yīng)的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用蛋白免疫印跡、凝膠遷移率電泳、逆轉(zhuǎn)錄PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、GRE體外轉(zhuǎn)錄激活分析等技術(shù)，分以下3個(gè)部分進(jìn)行了探討：1)首先對(duì)LPS致SIRS-腫損傷組大鼠血清皮質(zhì)醇、肺組織細(xì)胞GR表達(dá)和DNA結(jié)合力的變化特點(diǎn)進(jìn)行分析；研究LPS+Dex、LPS+Dex+Dex治療組大鼠肺組織細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體DNA結(jié)合力的變化，闡明LPS致SIRS-肺損傷組大鼠存在著內(nèi)源性和外源性的GC抵抗及其可能機(jī)制；2)通過研究LPS+Dex治療組大

2、鼠肺組織細(xì)胞中GR輔伴侶蛋白Bcl-2相關(guān)抗凋亡蛋白-1(Bcl-2-associatedathanogene1，BAG-1)表達(dá)變化及其與GR的相互作用關(guān)系，闡明在LPS+Dex治療組大鼠肺組織細(xì)胞中存在著BAG-1-GR信號(hào)通路；3)構(gòu)建BAG-1真核表達(dá)質(zhì)粒載體以及RNA干擾質(zhì)粒載體，建立過量表達(dá)BAG-1以及沉默BAG-1基因表達(dá)的肺泡巨噬細(xì)胞(alveolarmacrophages，Ams)模型，從正反兩個(gè)方面研究BAG-1-

3、GR信號(hào)通路中BAG-1信號(hào)分子表達(dá)量對(duì)細(xì)胞GR轉(zhuǎn)錄激活活性以及炎性細(xì)胞因子釋放的調(diào)控作用。結(jié)果1.LPS致SIRS-肺損傷組大鼠早期血清皮質(zhì)醇濃度有顯著升高，于致傷后4h左右達(dá)高峰(P＜0.01)，之后逐漸回落，但仍顯著高于正常對(duì)照；肺組織細(xì)胞中GRmRNA表達(dá)于致傷后2h明顯降低(P＜0.01)，4h降至最低水平，以后逐漸恢復(fù)，24h基本恢復(fù)至正常水平；GR蛋白表達(dá)在致傷后4h就己明顯減少(P＜0.01)，8h降到最低，24h仍維

4、持在低水平；糖皮質(zhì)激素受體DNA結(jié)合力于致傷1h降至最低(P＜0.01)，以后均維持在低水平。 2.LPS+Dex治療組大鼠于致傷后1h，糖皮質(zhì)激素受體DNA結(jié)合力較對(duì)照組稍有增強(qiáng)，2h開始逐漸下降，4h已明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，24h降至最低水平；LPS+Dex+Dex追加治療組糖皮質(zhì)激素受體DNA結(jié)合力與LPS+Dex治療組比較，無明顯差異(P＞0.05)。 3.LPS+Dex治療組大鼠于致傷后4h，肺組織細(xì)

5、胞總蛋白中BAG-1L表達(dá)顯著增加(P＜0.01)；各時(shí)相點(diǎn)BAG-1S表達(dá)均無明顯差異(P＞0.05)。肺組織細(xì)胞核蛋白中只能檢測(cè)到BAG-1L表達(dá)，其表達(dá)量呈逐漸增加趨勢(shì)，致傷后12h核內(nèi)BAG-1L表達(dá)達(dá)到峰值。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：正常大鼠肺組織核蛋白中不存在BAG-1L與GR結(jié)合，LPS+Dex治療組大鼠肺組織核蛋白中二者存在著相互結(jié)合；核蛋白中BAG-1L表達(dá)量與糖皮質(zhì)激素受體DNA結(jié)合力呈負(fù)相關(guān)(r=-0.986，P＜0

6、.05)。 4.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：Dex作用Ams后4h，胞質(zhì)中BAG-1陽性染色顯著增強(qiáng)；LPS+Dex作用后4h，胞核中BAG-1的陽性染色顯著增強(qiáng)。WesternBlot檢測(cè)結(jié)果顯示：Dex及LPS+Dex作用Ams后4h，總蛋白中BAG-1L表達(dá)明顯增加(P＜0.01)；LPS+Dex作用后12h，核蛋白中BAG-1L表達(dá)達(dá)到峰值(P＜0.01)。 5.成功構(gòu)建BAG-1真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3.1-

7、BAG以及RNA干擾質(zhì)粒載體psiBAG-Ad-2，建立過量表達(dá)BAG-1以及”沉默”BAG-1基因表達(dá)的Ams模型。LPS+Dex作用過量表達(dá)BAG-1的Ams，GR轉(zhuǎn)錄活性明顯降低，細(xì)胞上清中TNF-α含量升高；反之，LPS+Dex作用“沉默”BAG-1基因表達(dá)的Ams，GR轉(zhuǎn)錄活性明顯升高，細(xì)胞上清中TNF-α含量明顯降低。結(jié)論1.SIRS-肺損傷大鼠處于高GC、低GR表達(dá)、低DNA結(jié)合力的應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體存在著內(nèi)源性GC抵抗。這

8、種內(nèi)源性GC抵抗可能與GC高親和力的GR(GRH)表達(dá)下調(diào)有關(guān)。 2.外源性GC可以短暫增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體DNA結(jié)合力，這種促進(jìn)效應(yīng)可能與外源性GC激活GC低親和力的GR(GRL)有關(guān)；但外源性GC不能有效維持糖皮質(zhì)激素受體DNA結(jié)合力，在致傷后4h己出現(xiàn)外源性GC抵抗，該GC抵抗與GC濃度無關(guān)。 3.BAG-1L作為GR的輔伴侶蛋白，其表達(dá)增加并協(xié)同GR共同核移位，負(fù)向調(diào)控糖皮質(zhì)激素受體DNA結(jié)合力，該機(jī)制可能是導(dǎo)致L