炎癥因子加重脂質(zhì)介導(dǎo)的腎臟損害及PPAR-γ激動劑的保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、多種腎臟疾病存在著脂代謝異常，高脂血癥本身也參與了腎臟疾病的進(jìn)展。越來越多的證據(jù)表明腎小球硬化與動脈粥樣硬化有相似的病理改變和病理生理機(jī)制。以往的研究證明炎癥和動脈粥樣硬化有關(guān)，而各種腎臟疾病又往往存在著微炎癥狀態(tài)，因此有理由相信炎癥因子與脂質(zhì)是動脈粥樣硬化和腎小球硬化的共同病因。 氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是動脈粥樣硬化形成的重要危險因子，它通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面的植物血凝素樣受體(lectin-like oxidized

2、Iow-density lipoproteinreceptor，LOX-1)特異性結(jié)合，使內(nèi)皮功能失調(diào)，參與動脈粥樣硬化的形成。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體AI(ATP-binding cassettetransporterAl，ABCAl)是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(ABC)超家族的成員之一。ABCAl以ATP為能源促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂的流出，在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(RCT)和高密度脂蛋白(HDL)生成的起始步驟中ABCAl起重要作用，事實上ABCAl

3、可抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，具有抗早期動脈粥樣硬化的功能。原發(fā)和繼發(fā)性腎小球腎炎中的炎癥反應(yīng)是腎臟組織損傷的主要機(jī)制之一，已知炎癥因子如TNF-α、IL-1β可以調(diào)節(jié)Ox-LDL多種受體在內(nèi)皮等細(xì)胞的表達(dá)，促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成，然而在腎小球硬化中該炎癥因子的病理生理機(jī)制尚不明確。本研究旨在揭示炎癥因子IL-1β是否改變?nèi)四I小球系膜細(xì)胞株(HMCL)LOX-1、ABCAl受體的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞水平的膽固醇穩(wěn)態(tài)；研究PPAR-γ激動劑

4、在IL一1β存在情況下對LOX-1、ABCAl表達(dá)的影響，探討影響受體表達(dá)和延緩腎小球疾病進(jìn)展可能的干預(yù)措施。 方法： l、脂質(zhì)化學(xué)染色觀察HMCL對Ox-LDL的攝取，研究IL-1β對HMCL脂質(zhì)攝取的影響。 2、激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞計數(shù)檢測HMCL對熒光Dil標(biāo)記的Ox—LDL(Dil-Ox-LDL)的攝取，研究IL-1β和抗LOX-l抗體對脂質(zhì)攝取的影響，分析LOX-1受體的功能及IL-1β影響脂質(zhì)攝

5、取的可能作用途徑。3、Real-time PCR和Western BIot方法檢測IL-1β對LOX-1、ABCAl表達(dá)的影響及PPAR-γ激動劑15d-PGJ<,2>的作用。 結(jié)果： 1、油紅"O"染色發(fā)現(xiàn)HMCL攝取Ox-LDL，5ng／ml IL-1β刺激24小時，HMCL攝取Ox-LDL較對照明顯增加。 2、激光共聚焦檢查發(fā)現(xiàn)IL-1 β劑量和時間依賴性促進(jìn)HMCL攝取Dil-Ox-LDL。IL-1 β

6、2．5、5、10ng／m1分別刺激細(xì)胞24小時，10ng／m1組細(xì)胞內(nèi)平均熒光值達(dá)到峰值(基礎(chǔ)值的6.08倍)；5ng／m1 IL-l β刺激0、8、12、24小時，24小時組細(xì)胞內(nèi)平均熒光值達(dá)到峰值(基礎(chǔ)值的5.55倍)。 3、流式細(xì)胞儀計數(shù)發(fā)現(xiàn)IL-1β劑量和時間依賴性促進(jìn)HMCL攝取Dil-Ox-LDL。IL-1β 2.5、5、10ng／ml分別刺激細(xì)胞24小時，10ng／ml組細(xì)胞內(nèi)平均熒光值達(dá)到峰值(基礎(chǔ)值的7.36倍

7、)；5ng／ml IL-Iβ刺激0、8、12、24小時，24小時組細(xì)胞內(nèi)平均熒光值達(dá)到峰值(基礎(chǔ)值的5.93倍)。事先應(yīng)用抗LOX-1抗體共孵育2小時，IL-1β刺激組細(xì)胞內(nèi)平均熒光值下調(diào)為89.8％。 4、體外培養(yǎng)的HMCL表達(dá)LOX-1 mRNA和蛋白，IL-1β劑量和時間依賴性促進(jìn)LOX-1mRNA和蛋白的表達(dá)。IL-1β 2.5、5、10ng／ml分別刺激細(xì)胞12小時，10ng／ml組細(xì)胞LOX-1mRNA升高到峰值(基

8、礎(chǔ)值的6.57倍)；IL-1β(5ng／ml)刺激細(xì)胞0-24小時，3小時細(xì)胞LOX-1mRNA開始升高(基礎(chǔ)值的3.89倍)，6小時達(dá)高峰(基礎(chǔ)值的6.87倍)，后逐漸下降，24小時細(xì)胞LOX-1mRNA仍較對照升高(基礎(chǔ)值的2.58倍)。IL-1β 2.5、5、10ng／ml分別刺激細(xì)胞24小時，10ng／ml組LOX-1蛋白達(dá)到峰值(基礎(chǔ)值的2.57倍)；IL-1β(5ng／ml)刺激細(xì)胞0-24小時，24小時達(dá)高峰(基礎(chǔ)值的1.

9、88倍)。 5、Ox-LDL劑量和時間依賴性促進(jìn)LOX-1mRNA和蛋白表達(dá)。Ox-LDL 40βg／ml刺激細(xì)胞0-24小時，LOX-1mRNA于12小時達(dá)峰值(基礎(chǔ)值的3.97倍)，后逐漸下降，24小時和對照無差別。Ox-LDL 10、20、40、60μg／ml分別作用于細(xì)胞12小時，40μg／ml組達(dá)到峰值(基礎(chǔ)值的3.73倍)。IL-1β 5ng／ml與Ox-LDL共孵育，較40μg／ml單獨刺激組表達(dá)升高(為對照5.1

10、6倍)。Ox-LDL 40μg／ml刺激細(xì)胞0-24小時，LOX-1蛋白24小時達(dá)高峰(基礎(chǔ)值的1.79倍)。Ox-LDL 10、20、40、60μg／ml分別作用細(xì)胞24小時，40μg／ml組細(xì)胞LOX-1蛋白達(dá)到峰值(基礎(chǔ)值的1.8l倍)。IL-1β 5ng／ml與40μg／mlOx-LDL共孵育，LOX-1蛋白較單獨Ox-LDL刺激組表達(dá)升高(為對照2.28倍)。 6、HMCL在脂質(zhì)負(fù)荷的情況(40μg／ml Ox-LDL

11、預(yù)先孵育HMCL24小時)，IL-1β呈劑量和時間依賴性降低HMCL ABCA1mRNA和蛋白表達(dá)。IL-1β 2.5、5、10ng／ml分別刺激細(xì)胞12小時，10ng／ml組ABCAImRNA下降最明顯(為對照的14.16％)；IL-1β(5ng／ml)刺激細(xì)胞0-48小時，48小時ABCA1mRNA下降最明顯(為對照的19.0％)。IL-1β 2.5、5、10ng／ml分別刺激細(xì)胞24小時，10ng／ml組ABCAI蛋白降為對照47

12、.97％，IL-1β(5ng／ml)刺激細(xì)胞0-48小時，48小時降為對照50.62％。 7、15d-PGJ<,2>呈劑量依賴性抑制IL-1β誘導(dǎo)的LOX-1mRNA和蛋白表達(dá)。與單純IL-1β(5ng／ml)刺激組相比，15d-PG7。濃度2.5，5，10μmol／L處理組細(xì)胞LOX-1mRNA表達(dá)分別下調(diào)為73.13％，66.54％，35.23％，15d-PGJ<,2>濃度5和10μmol／L處理組細(xì)胞LOX-1蛋白表達(dá)分別

13、下調(diào)為82.39％和63.17％。 8、15d-PGJ<,2>呈劑量依賴性的增加IL-1β抑制的ABCAlmRNA和蛋白表達(dá)。與單純IL-1β(5ng／ml)刺激組相比，15d-PGJ<,2>濃度2.5，5，10μmol／L的處理組細(xì)胞ABCAlmRNA表達(dá)分別升高為1.34、2.15、2.88倍，15d-PGJ<,2>濃度5和10μmol／L處理組細(xì)胞ABCAl蛋白質(zhì)表達(dá)分別升高為1.16、1.54倍。 結(jié)論：本實驗條

14、件下 1、HMCL基礎(chǔ)狀態(tài)下攝取Ox-LDL，炎癥因子IL-1β促進(jìn)HMCL對Ox-LDL的攝取。 2、IL-1β促進(jìn)Ox-LDL的特異性受體LOX-lmRNA及蛋白的表達(dá)，抗LOX-1抗體部分阻斷IL-1β誘導(dǎo)的HMCL對Ox-LDL攝取，說明IL-1β可能通過LOX-1途徑增強(qiáng)對Ox-LDL攝取。 3、Ox-LDL在一定濃度(10μg／ml-40μg／ml)范圍內(nèi)劑量和時間依賴性促進(jìn)HMCLLOX-lmRNA