PPAR-γ激動(dòng)劑對LPS誘導(dǎo)的大鼠急性腹膜透析相關(guān)性炎癥效應(yīng)干預(yù)的研究.pdf

1、腹膜炎仍然是導(dǎo)致腹膜透析失敗的主要原因。近年來，革蘭氏陰性細(xì)菌所致的腹透相關(guān)性腹膜炎發(fā)生率顯著上升。革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)物脂多糖是誘導(dǎo)腹膜炎進(jìn)展、腹膜纖維化的重要原因。TLR4是LPS的特異性受體，LPS與TLR4結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。TLR4與其配體結(jié)合后激活多條信號通路而啟動(dòng)炎癥信號瀑布效應(yīng)。JAK/STAT是一條重要的細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的炎癥效應(yīng)中有重要作用。LPS直接激活JAK/STAT信號通路，誘導(dǎo)IL1β、I

2、L-6、MCP-1等促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生。LPS刺激巨噬細(xì)胞的一條早期信號即是活化STAY1。LPS誘導(dǎo)內(nèi)源性IFN-β的生成，隨后激活STAr-1α誘導(dǎo)CD40基因表達(dá)。STATs可上調(diào)脂多糖結(jié)合蛋白、MD-2等LPS信號分子提示STATs可能導(dǎo)致敗血癥時(shí)的炎癥放大效應(yīng)。過氧化物酶體增殖物活化受體-γ是核受體家族成員之一，參與調(diào)控脂質(zhì)代謝、糖代謝、能量穩(wěn)態(tài)、脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化等過程。近年報(bào)道PPAR-γ可通過抑制NF-κB、AP-1

3、和STAT1等轉(zhuǎn)錄因子活性而發(fā)揮廣泛的抗炎效應(yīng)。PPAR-γ配體主要有天然和人工合成兩大類，均可通過PPAR-γ依賴和非依賴性機(jī)制，從不同水平調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多條炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中對促炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄抑制是其抗炎效應(yīng)的主要分子基礎(chǔ)。我們已報(bào)道體外培養(yǎng)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)性表達(dá)PPAR-γ，LPS刺激后其表達(dá)顯著上調(diào)；PPAR-γ配體15d-PGJ2可顯著抑制LPS介導(dǎo)的CD40mRNA和ICAM-1蛋白的表達(dá)，提示PPAR-γ可能通過

4、負(fù)性調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)分泌而參與腹腔局部防御。然而，急性腹膜炎時(shí)，PPAR-γ配體對腹膜組織TLR4的表達(dá)有何影響?如何調(diào)節(jié)STAT信號通路及其炎癥效應(yīng)?體內(nèi)腹膜間皮細(xì)胞是否亦表達(dá)PPAR-γ?PPAR-γ配體在體內(nèi)外抗炎效應(yīng)是否一致?這些問題的研究目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究擬從體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)角度探討PPAR-γ激動(dòng)劑干預(yù)腹膜透析相關(guān)性腹腔局部炎癥的作用及其機(jī)制。 第一部分體外研究PPAR-γ激動(dòng)劑對LPS誘導(dǎo)大鼠腹膜間

5、皮細(xì)胞STAT1信號活化及其炎癥效應(yīng)的影響 (一)目的： 觀察PPAR-γ激動(dòng)劑對LPS誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞STAT1信號蛋白活化及其炎癥效應(yīng)的影響，初步揭示PPAR-γ激動(dòng)劑調(diào)控腹膜間皮細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)的作用及機(jī)制。 (二)方法： 體外分離、培養(yǎng)第二代SD雄性大鼠腹膜間皮細(xì)胞，隨機(jī)分組及干預(yù)因素如下： 1)對照組：培養(yǎng)基LPS組：培養(yǎng)基羅格列酮組： 分別在LPS刺激0min、15min、30

6、min、60min、120min、24h后收獲細(xì)胞，24h收獲細(xì)胞上清液。用Westernblotting檢測細(xì)胞p-STAT1、STAT1蛋白的表達(dá)；用ELISA法檢測培養(yǎng)上清液IL-6蛋白分泌水平。 (三)結(jié)果： LPS刺激15min后，大鼠腹膜間皮細(xì)胞p-STAT1蛋白表達(dá)明顯升高，60min時(shí)其表達(dá)達(dá)高峰，持續(xù)至120min。羅格列酮組60min時(shí)p-STAT1表達(dá)明顯下調(diào)，并持續(xù)至120min。GW9662特異

7、性阻斷PPAR-γ后，p-STAT1表達(dá)仍顯著下調(diào)。15d-PGJ2組各時(shí)間點(diǎn)p-STAT1表達(dá)均明顯下調(diào)。6W9662特異性阻斷PPAR-γ后，p-STAT1表達(dá)仍下調(diào)。GW9662特異性阻斷PPAR-γ前及阻斷后，羅格列酮、15d-PGJ2均明顯減少LPS誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞IL-6的分泌。 (四)結(jié)論： 1.羅格列酮和15d-PGJ2可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞STAT1信號分子活化而發(fā)揮抗炎效應(yīng)。

8、 2.羅格列酮和15d-PGJ2均可經(jīng)PPAR-γ依賴性和非PPAR-γ依賴性途徑發(fā)揮抗炎活性。 第二部分體內(nèi)研究第一章PPAR-γ、TLR4表達(dá)及STAT1信號活化在LPS誘導(dǎo)大鼠腹膜透析相關(guān)性腹膜炎中的作用 (一)目的： 觀察LPS誘導(dǎo)大鼠腹膜透析相關(guān)性急性腹膜炎中腹膜組織PPAR-γ、TLR4表達(dá)及STAT1信號活化與腹腔局部炎癥的相關(guān)性，初步探討LPS誘導(dǎo)大鼠腹膜透析相關(guān)性急性腹膜炎的發(fā)生機(jī)制。

9、 (二)方法： 30只雄性SD大鼠隨機(jī)分成5組，每組6只。對照組；LPS4h組；LPS8h組；LPS12h組；LPS24h組。一次性經(jīng)腹腔注入LPS，在各時(shí)間點(diǎn)最后4h一次性經(jīng)腹腔注入4.25％乳酸鹽腹膜透析液，對照組僅注入腹膜透析液，各組透析液留腹4h。分別在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物。留取腹水、腸系膜組織，于-80C°凍存待測各觀察指標(biāo)。用RT-PCR檢測腹膜組織PPAR-γ、TLR4mRNA的表達(dá)；Westernblot檢測腹膜組

10、織PPAR-γ、TLR4、p-STAT1、STAT1蛋白的表達(dá)；免疫組織化學(xué)檢測腹膜組織PPAR-γ的表達(dá)；ELISA法檢測腹水IL-6蛋白的水平。常規(guī)腹膜組織Masson染色和腹水白細(xì)胞計(jì)數(shù)。 (三)結(jié)果： 免疫組織化學(xué)顯示大鼠腹膜間皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)性表達(dá)PPAR-γ。LPS作用后，4h組大鼠腹膜組織PPAR-γmRNA表達(dá)顯著下降，8h組明顯升高，12h組及24h組PPAR-γmRNA表達(dá)減弱，與對照組相比差異無顯著性。P

11、PAR-γ蛋白表達(dá)在4h明顯升高，并持續(xù)高表達(dá)至24h。TLR4mRNA及蛋白表達(dá)在4h明顯升高，并持續(xù)高表達(dá)至24h。LPS刺激不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腹膜組織PPAR-γ與TLR4蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。LPS刺激4h后p-STAT1表達(dá)明顯升高，其后高表達(dá)持續(xù)至24h；LPS作用4h、8h時(shí)大鼠腹水中IL-6濃度顯著增多，12h后其濃度接近對照組水平。壁層腹膜石蠟切片Masson染色可見LPS作用不同時(shí)間組腹膜組織明顯水腫；各組間腹水白細(xì)胞計(jì)數(shù)無

12、顯著性差異。 (四)結(jié)論： 1.大鼠腹膜組織結(jié)構(gòu)性表達(dá)PPAR-γ。 2.LPS可顯著誘導(dǎo)大鼠腹膜組織PPAR-γ、TLR4mRNA及蛋白高表達(dá)。 3.PPAR-γ與TLR4蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。 4.LPS可激活大鼠腹膜組織STAT1信號蛋白，誘導(dǎo)炎癥效應(yīng)。 5.PPAR-γ、TLR4表達(dá)及STAT1信號蛋白活化參與LPS誘導(dǎo)的腹腔局部炎癥過程。 第二章PPAR-γ激動(dòng)劑對急性腹膜透

13、析相關(guān)性腹膜炎鼠PPAR-γ、TLR4表達(dá)及STAT1信號活化的影響 (一)目的： 觀察PPAR-γ激動(dòng)劑對LPS誘導(dǎo)大鼠腹膜透析相關(guān)性急性腹膜炎中PPAR-γ表達(dá)、TLR4表達(dá)、STAT1活化及腹腔局部炎癥的影響，體內(nèi)進(jìn)一步探討PPAR-γ激動(dòng)劑抑制腹膜透析相關(guān)性急性腹膜炎的作用及機(jī)制。 (二)方法： 24只雄性SD大鼠，隨機(jī)分成4組，每組6只。對照組；LPS組；羅格列酮預(yù)處理組；15d-PGJ2預(yù)處理

14、組。其中羅格列酮(20mg/kg·d灌胃)、15d-PGJ2，在注入LPS4h后一次性經(jīng)腹腔注入4.25％乳酸鹽腹膜透析液(90ml/kg)，對照組僅注入腹膜透析液，各組透析液留腹4h，8h后處死動(dòng)物。留取腹水、腸系膜組織-80C°凍存待測。用RT-PCR檢測腹膜組織PPAR-γ、TLR4mRNA的表達(dá)；Westernblot檢測腹膜組織PPAR-γ、TLR4、p-STAT1、STAT1蛋白的表達(dá)；ELISA法檢測腹水中IL-6濃度。常

15、規(guī)腹膜組織Masson染色和腹水白細(xì)胞計(jì)數(shù)。 (三)結(jié)果： 與對照組比較，LPS組大鼠腹膜組織PPAR-γ、TLR4mRNA及蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)；羅格列酮組PPAR-γ、TLR4mRNA表達(dá)顯著高于LPS組，但其蛋白表達(dá)顯著降低；15d-PGJ2組PPAR-γmRNA及其蛋白表達(dá)顯著降低，TLR4mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，但其蛋白表達(dá)降低。羅格列酮、15d-PGJ2均明顯上調(diào)LPS誘導(dǎo)的p-STAT1表達(dá)。LPS組大鼠腹水IL

16、-6濃度顯著高于對照組，羅格列酮組腹水IL-6濃度顯著低于LPS組。15d-PGJ2預(yù)處理組IL-6分泌有減少的趨勢，但與LPS組相比，未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。羅格列酮、15d-PGJ2均明顯減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠腹膜組織水腫。各組間腹水白細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著性差異。 (四)結(jié)論： 1.羅格列酮顯著上調(diào)LPS誘導(dǎo)的大鼠腹膜組織PPAR-γmRNA表達(dá)，下調(diào)其蛋白表達(dá)；15d-PGJ2則下調(diào)PPAR-γmRNA及蛋白的表達(dá)。 2.

17、羅格列酮、15d-PGJ2均顯著上調(diào)LPS誘導(dǎo)的急性腹膜炎鼠腹膜組織TLR4mRNA的表達(dá)，下調(diào)其蛋白表達(dá)。 3.羅格列酮、15d-PGJ2均可顯著上調(diào)LPS誘導(dǎo)的大鼠腹膜組織p-STAT1表達(dá)，其意義有待進(jìn)一步探討。 4.羅格列酮可明顯減少LPS誘導(dǎo)的大鼠腹膜組織分泌炎癥因子IL-6：羅格列酮、15d-PGJ2均可明顯減輕炎癥狀態(tài)時(shí)的腹膜水腫，提示兩者可能在CAPD相關(guān)性腹膜炎治療中發(fā)揮積極效應(yīng)。 全文總結(jié)：