糖尿病大鼠腎組織中PPAR-γ激動(dòng)劑對(duì)TGF-β1、c-Ski調(diào)控作用的研究.pdf

1、目的:糖尿病腎病(DN)是終末期腎病(ESRD)最主要的致病因素，也是糖尿病(DM)最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。DN的發(fā)病機(jī)制有很多，包括氧化應(yīng)激(ROS)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活、炎癥因子和致纖維化因子，如TGF-β1、纖溶酶原激活劑抑制物1(PAI-1)的釋放等。TGF-β/Smad是腎臟纖維化的關(guān)鍵通路之一，TGF-β1更是腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因素之一。
　　 c-Ski(cellular Sloan-Ket

2、tering institute)是鳥(niǎo)類癌基因v-Ski在人組織中的細(xì)胞內(nèi)同源物，SnoN(Ski-related novel gene)是Ski原癌基因家族的成員之一，比Ski的發(fā)現(xiàn)稍晚。他們主要的生物學(xué)功能就是通過(guò)與Smad2/3及Smad4結(jié)合，阻遏Smad復(fù)合物激活TGF-β1下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路起負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。但這些研究主要集中在腫瘤發(fā)生上，關(guān)于其在DN發(fā)病過(guò)程中是否也存在相似的機(jī)制目前尚不明確。

3、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)是一類配體激活的核受體，TZDs（噻唑烷二酮類）作為PPAR-γ最重要的外源性激活劑，是一種新型的胰島素增敏劑。本研究借助建立DM大鼠模型，通過(guò)施加PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮干預(yù)，觀察腎組織中c-Ski和TGF-β1的表達(dá)變化，探討PPAR-γ與c-Ski之間的相互聯(lián)系和對(duì)DN的影響，也為PPAR-γ對(duì)DN治療機(jī)制的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，開(kāi)闊新的思路。
　　 方法:以尾靜脈小劑量注射鏈

4、脲佐菌素（STZ，40 mg/kg）的方法建立糖尿病大鼠模型，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC)、糖尿病組(DM)和藥物干預(yù)組[吡格列酮15mg/(kg·d)，PT]。自造模成功之日起，每周測(cè)量體質(zhì)量，每2周測(cè)定血糖，實(shí)驗(yàn)8周后處死各組大鼠。死前1天代謝籠收集24 h尿液并檢測(cè)24 h尿蛋白定量(UMA);股動(dòng)脈取血檢測(cè)血尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG);留取部分腎皮質(zhì)提取RNA，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)腎皮質(zhì)TGF-β1、c-

5、Ski和SnoNmRNA水平;剖開(kāi)腹腔，取左腎稱重，迅速放入10％福爾馬林固定，同時(shí)留取部分右腎于-80℃凍存。腎臟肥大指數(shù)(KI)用左腎/體重比(LKW/BWT)表示。HE染色觀察腎組織的病理形態(tài)，免疫組化法檢測(cè)腎小球中TGF-β1和c-Ski的蛋白表達(dá)情況，并進(jìn)行半定量分析。
　　 結(jié)果:1.在實(shí)驗(yàn)期間，正常組大鼠血糖與體質(zhì)量正常且穩(wěn)定，糖尿病大鼠體重血糖顯著升高并維持在高水平，體質(zhì)量持續(xù)減輕，與正常組相比差異顯著(P＜0.

6、01);各項(xiàng)腎功能相關(guān)指標(biāo)包括24 h尿量及尿微量白蛋白(UMA)、血尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)和腎臟肥大指數(shù)(LKW/BWT)均呈現(xiàn)進(jìn)行性升高，差異顯著(P＜0.01)，表明DM大鼠腎臟組織發(fā)生了病變，并發(fā)DN。2.Real-timePCR結(jié)果顯示糖尿病大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1 mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，但是c-Ski和SnoN mRNA水平較正常組無(wú)顯著差異（P＞0.05）;免疫組化結(jié)果顯示，與正常組相比，TGF-

7、β1蛋白表達(dá)在DM組明顯增高(P＜0.01)，而c-Ski蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，提示c-Ski對(duì)TGF-β1的抑制作用可能主要表達(dá)在蛋白水平。3.施加吡格列酮藥物干預(yù)，PT組血糖值較DM組顯著下降(P＜0.01)，但仍明顯高于NC組(P＜0.05);體質(zhì)量控制前兩周不明顯，第四周開(kāi)始下降趨勢(shì)漸緩，較DM組差異顯著(P＜0.01);相關(guān)腎功能指標(biāo)包括24th尿量及尿微量白蛋白(UMA)、血尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)和腎

8、肥大指數(shù)(LKW/BWT)在吡格列酮治療后均顯著下降(P＜0.05);免疫組化結(jié)果表明，PT組大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1蛋白表達(dá)低于DM組(P＜0.05)，而c-Ski蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.01);Real-time PCR的結(jié)果顯示，PT組的大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1 mRNA水平明顯降低(P＜0.05)，而c-Ski的mRNA水平較DM組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論:1.TGF-β1是導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維

9、化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，c-Ski可以通過(guò)阻止Smad復(fù)合物形成，抑制其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。DN中可能是c-Ski的表達(dá)下調(diào)減少了對(duì)TGF-β/Smad途徑的阻斷作用，為T(mén)GF-β1創(chuàng)造了一個(gè)理想的促纖維化環(huán)境，使TGF-β1可以不受控制的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)?？刂芻-Ski的表達(dá)對(duì)于下調(diào)TGF-β1的促纖維化效應(yīng)，控制腎臟纖維化，延緩DN進(jìn)程有重要意義。2.熒光定量PCR結(jié)果顯示，c-Ski mRNA水平在在各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而TGF-β1在DM