LXR激動劑TO901317對LPS誘導(dǎo)的新生小鼠心肌炎癥和自噬的影響.pdf

1、研究背景:
　　復(fù)雜先天性心臟疾病的新生兒，在心臟手術(shù)后，常常會發(fā)生致死性術(shù)后并發(fā)癥，如低心輸出量綜合征。除了手術(shù)和體外循環(huán)創(chuàng)傷本身，體外循環(huán)下細(xì)胞損傷及破碎細(xì)胞炎癥因子釋放也可以激起全身炎癥反應(yīng)。此外，體外循環(huán)還與心臟術(shù)后血液中內(nèi)毒素水平的上升密切相關(guān)。血液總內(nèi)毒素的增加，可以導(dǎo)致新生小鼠血液中促炎細(xì)胞因子釋放，如TNF-α和IL-6。而循環(huán)中細(xì)胞因子水平的升高與心臟功能受損密切相關(guān)。
　　大量體內(nèi)及體外研究結(jié)果表明，LX

2、R是許多炎癥相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。LXR表達(dá)于小鼠心肌中，并且在心肌損傷過程中起著保護(hù)作用。使用LXR激動劑GW3965預(yù)處理可顯著緩解心肌缺血損傷小鼠的心臟缺血后左心舒張末壓的升高，并且進(jìn)一步改善缺血后所引起的左心室發(fā)展壓的降低。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，在LPS以及血管緊張素-Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥過程中，LXR可以通過抑制NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用。
　　自噬是細(xì)胞內(nèi)自我消化的一個(gè)高度保守的過程，具有降解和回收利用長壽蛋白質(zhì)以及細(xì)胞

3、器的作用。已有研究表明，自噬在心肌缺血損傷的發(fā)病機(jī)制扮演著重要的角色。而且，在缺血引發(fā)炎癥損傷時(shí)，自噬起著心肌保護(hù)作用。此外，LPS刺激可促進(jìn)乳鼠心肌細(xì)胞自噬，并且自噬通過抑制凋亡而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)的作用。前期研究結(jié)果表明，通過LXR激動劑TO901317活化內(nèi)源性LXR配體，可以抑制乙醇誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而防止新生小鼠浦肯野細(xì)胞凋亡。因此，LXR對LPS誘導(dǎo)的心肌組織炎癥損傷的抗炎作用是否與自噬相關(guān)值得進(jìn)一步研究和探討。
　　

4、本課題分為LXR激動劑TO901317與新生小鼠心肌炎癥，以及TO901317與新生小鼠心肌自噬及凋亡兩個(gè)部分進(jìn)行研究。觀察TO901317對新生小鼠心肌炎性反應(yīng)的作用，并分別從顯微、超微和分子層面觀察在急性LPS刺激下TO901317對心肌自噬的作用。與此同時(shí)，我們還進(jìn)一步探索了TO901317對心肌組織炎癥、自噬和凋亡影響的潛在機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.TO901317與新生小鼠心肌炎癥:(1)建立LPS誘導(dǎo)的新生

5、小鼠全身炎癥模型以及TO抗炎修復(fù)模型;(2)HE染色，計(jì)數(shù)心肌組織炎性細(xì)胞數(shù);(3)熒光定量PCR檢測心肌組織IL-6及TNF-αmRNA含量;(4) Western Blot檢測心肌組織NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65、IκB-α和磷酸化IκB-α的蛋白水平。
　　2.TO901317與新生小鼠心肌自噬以及凋亡:(1)Western Blot檢測LC3的表達(dá);(2)免疫熒光染色含LC3斑點(diǎn)的自噬小體;(3)透射電鏡觀

6、察自噬小體;(4) TUNEL檢測試劑盒檢測心肌組織凋亡細(xì)胞;(5)Western Blot檢測Akt和磷酸化Akt蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1.單次大劑量LPS腹腔注射可以誘導(dǎo)新生小鼠心肌的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為心肌組織明顯的炎性細(xì)胞浸潤，心肌組織促炎細(xì)胞因子的TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平分別上調(diào)2.26倍(p＜0.01)和1.48倍(p＜0.01)。
　　2.經(jīng)過TO預(yù)處理的新生小鼠的心肌組織，在受到單次大劑

7、量LPS腹腔注射后，表現(xiàn)出較輕的炎性細(xì)胞浸潤，心肌組織促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)水平上升較未經(jīng)過TO預(yù)處理新生小鼠少，分別減少40％(p＜0.01)和36％(p＜0.05)。
　　3.TO預(yù)處理的新生小鼠，在接受LPS刺激后，心肌組織內(nèi)NF-κB磷酸化水平較單純LPS刺激組進(jìn)一步降低56.6％(p＜0.01)。IκB-α降解程度同樣也進(jìn)一步降低28.2％(p＜0.01)。提示TO對新生小鼠心肌組織的抗炎作用與

8、NF-κB信號通路有關(guān)。
　　4.單次大劑量LPS腹腔注射后，新生小鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/GAPDH比值增加3.32倍(p＜0.01)，同時(shí)免疫熒光染色可見心肌細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記有LC3的斑點(diǎn)數(shù)目增加5.34倍(p＜0.05)。
　　5.經(jīng)過TO預(yù)處理的新生小鼠的心肌組織，在受到單次大劑量LPS腹腔注射后，相比單純LPS刺激的新生小鼠，LC3-Ⅱ/GAPDH比值進(jìn)一步增加1.15倍(p＜0.01)，并且免疫熒光染色后LC3陽性斑點(diǎn)

9、數(shù)增加0.68倍(p＜0.05)。透射電鏡下可見同一視野下自噬小體以及自溶小體，進(jìn)一步確證自噬的發(fā)生。
　　6.透射電鏡下單純LPS刺激的新生小鼠心肌組織內(nèi)可見凋亡小體。TUNEL-POD染色并計(jì)數(shù)TUNEL陽性凋亡細(xì)胞，結(jié)果顯示LPS可增加新生小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡（133.3±23.1 vs.67.6±4.7/105細(xì)胞核， p＜0.01），而經(jīng)過TO預(yù)處理的新生小鼠在受到LPS刺激后TUNEL陽性細(xì)胞核數(shù)減少31％(p＜0.0

10、5)。提示LXR激動劑TO在心肌組織中具有抗凋亡作用。
　　7.免疫蛋白印跡技術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性LPS刺激可使心肌組織Akt磷酸化水平降低37％(p＜0.01，DMSO+LPS vs.DMSO+NaCl)，而TO預(yù)處理的新生小鼠心肌內(nèi)Akt磷酸化水平進(jìn)一步降低27％(p＜0.05，TO+LPS vs.DMSO+LPS)。
　　結(jié)論:
　　1.LXR激動劑TO901317可以通過抑制NF-κB信號通路的活化，從而降低LPS