一種新β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-38的克隆、表達(dá)及酶特性研究.pdf

1、【目的】 本研究以國(guó)外最新研究為參考，結(jié)合國(guó)內(nèi)研究狀況，應(yīng)用基因克隆、表達(dá)技術(shù)，研究深圳市人民醫(yī)院新發(fā)現(xiàn)的β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因CTX-M-38的耐藥功能及其表達(dá)產(chǎn)物的各種理化及酶學(xué)特性。對(duì)新型β-內(nèi)酰胺酶基因的研究，不僅為此類耐藥細(xì)菌的檢測(cè)、治療及監(jiān)控提供依據(jù)，也為新β-內(nèi)酰胺酶抑制劑及新抗菌藥物的研制和開發(fā)提供必要條件，同時(shí)豐富了細(xì)菌耐藥基因知識(shí)庫，也可為臨床治療這種細(xì)菌感染合理應(yīng)用抗生素、預(yù)防和控制耐藥菌株的出現(xiàn)和傳播以及細(xì)

2、菌的流行病學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指導(dǎo)。 【方法】 1．選取適合的受體菌，通過質(zhì)粒接合試驗(yàn)研究耐藥質(zhì)粒的傳遞方式。 2．由臨床產(chǎn)ESBLs耐藥菌株中提取質(zhì)粒，用PCR法擴(kuò)增相關(guān)基因的DNA片段。 3．用PCR方法擴(kuò)增接合子耐藥基因片斷，并測(cè)序，然后利用 DNAMAN 軟件與CTX-M-38基因進(jìn)行對(duì)比分析。 4．選用β-內(nèi)酰胺酶基因高效表達(dá)的天然蛋白原核表達(dá)載體PET-26b(+)載體，用NdeI和X

3、hoI內(nèi)切酶雙酶切。 5．用NdeI和XhoI內(nèi)切酶雙酶切臨床耐藥菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。 6．用DNA連接酶連接上述酶切產(chǎn)物，克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH<,5>和BL<,21>。 7．提取大腸桿菌DH<,5>。質(zhì)粒，雙酶切鑒定。 8．并用PCR法擴(kuò)增其大腸桿菌DH<,5>。質(zhì)粒，然后測(cè)序鑒定。 9．超聲破壁法制備臨床菌株、接合子和誘導(dǎo)表達(dá)克隆菌株的β-內(nèi)酰胺酶粗提液，用PAGE電泳分析其等電點(diǎn)。

4、 10．分別比較重組菌、臨床菌株、接合子及其對(duì)照菌(只含空質(zhì)粒載體)的耐藥性差異，分析耐藥基因賦予細(xì)菌的耐藥特性。 【結(jié)果】 1．經(jīng)過VITEK—Ⅱ全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)的鑒定，接合子為大腸桿菌，與選取的受體菌相同，通過ESBLs初篩和確證試驗(yàn)，接合子為ESBLs陽性株。 2．對(duì)接合子和臨床肺炎克雷伯菌所含CTX-M-38質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示接合子和臨床菌株含同一個(gè)耐藥基因，基因片段長(zhǎng)度為904bp。

5、 3．對(duì)接合子PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，然后測(cè)序，結(jié)果顯示與該課題組之前申報(bào)CTX-M-38的基因序列完全相同。 4．提取陽性克隆菌質(zhì)粒，用XhoI和NdeI雙酶切后產(chǎn)生941bp和5230bp的片斷，分別與對(duì)照酶切后PCR產(chǎn)物和酶切后PET-26b(+)載體片斷大小相同，證明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入，表明克隆成功。 5．PCR擴(kuò)增陽性克隆菌質(zhì)粒，并對(duì)擴(kuò)增片斷測(cè)序分析，結(jié)果顯示與該課題組之前申報(bào)CTX-M-38 的基因序

6、列完全相同，表明克隆過程中未發(fā)生基因突變。 6．對(duì)產(chǎn)CTX-M-38 臨床分離菌株、接合子、重組BL<,21>菌(IPTG誘導(dǎo))進(jìn)行等電點(diǎn)測(cè)定，重組子PI為8.09，產(chǎn)CTX-M-38臨床分離菌PI為8.04。考慮到臨床株可能含有其他耐藥基因編碼的類時(shí)似蛋白影響，故以重組子等電點(diǎn)為CTX-M-38 的等電點(diǎn)即為8.09。 7．CTX-M-38 型臨床分離株、接合子耐藥性分析，紙片擴(kuò)散法結(jié)果顯示該菌株以及接合子對(duì)多種青霉素

7、、窄譜頭孢菌素及頭孢曲松耐藥，但對(duì)美洛培南、亞胺培南、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南敏感。 8．CTX-M-38 臨床株、接合子、IPTG 誘導(dǎo)重組BL<,21>MIC 結(jié)果顯示，產(chǎn)CTX-M-38的臨床分離菌對(duì)頭孢噻肟和氨芐西林/舒巴坦的耐藥性較強(qiáng)，對(duì)其它藥物的耐藥性較弱。接合子除對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林/舒巴坦敏感外，其耐藥性同臨床株基本相同。IPTG誘導(dǎo)的重組BL<,21>菌只對(duì)頭孢噻肟敏感，它含有的PET-26b(+)

8、是卡那霉素抗性的，所以對(duì)于胺卡那霉素耐藥。 【結(jié)論】 1．本課題組在深圳人民醫(yī)院首次發(fā)現(xiàn)一種新的 CTX-M 型β-內(nèi)酰胺酶基因CTX-M-38，已經(jīng)做了測(cè)序鑒定及世界權(quán)威專家的確認(rèn)，GenBank 注冊(cè)號(hào)為(AY822595)，已被收錄于美國(guó)Lahey 臨床醫(yī)學(xué)中心的專業(yè)網(wǎng)站(http：//www.lahey.org/Studies)。 2．本課題以目前國(guó)內(nèi)外引起醫(yī)院感染的細(xì)菌耐藥熱點(diǎn)問題為基礎(chǔ)，對(duì)含CTX-M

9、-38基因產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌(為主要產(chǎn)ESBLs的細(xì)菌)的耐藥機(jī)理進(jìn)行深入、系統(tǒng)的研究，證明細(xì)菌耐藥存在的自然轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，轉(zhuǎn)移后基因穩(wěn)定表達(dá)，耐藥性沒有改變，可以引起廣泛流行。 3．新基因CTX-M-38基因測(cè)序分析與bla<,CTX-M-14>(GenBank注冊(cè)號(hào)AF252622)最相近，僅出現(xiàn)1個(gè)核苷酸及1個(gè)氨基酸的差異。與bla<,CTX-M-9>比較有兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異，分別為Ser220→Arg和Ala231

10、→Val。根據(jù)氨基酸序列分析，本研究發(fā)現(xiàn)的 CTX-M-38 屬于 CTX-M-9 組。 4．CTX-M-38基因重組研究，在IPTG誘導(dǎo)下酶可穩(wěn)定表達(dá)，利用PAGE電泳分析CTX-M-38 基因編碼的β-內(nèi)酰胺酶等電點(diǎn)為8.09。 5．藥物敏感試驗(yàn)顯示，IPTG誘導(dǎo)的重組BL<,21>菌只對(duì)頭孢噻肟敏感，但不排除對(duì)青霉素和窄譜頭孢菌素類的耐藥。 6．新CTX-M-38 耐藥基因有可能成為引起醫(yī)院感染流行的危險(xiǎn)因