臨床分離陰溝腸桿菌產(chǎn)ESBLs特性及DRz抑制β-內(nèi)酰胺酶基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的 了解臨床分離的陰溝腸桿菌對p．內(nèi)酰胺類藥物的耐藥情況，研究陰溝腸桿菌產(chǎn)超廣譜p．內(nèi)酰胺酶的特性及探討10-23脫氧核酶抑制細(xì)菌p一內(nèi)酰胺酶基因表達(dá)效應(yīng)。 方法 瓊脂二倍稀釋法檢測藥物對59株陰溝腸桿菌臨床分離株的MIC，Nitrocefin顯色法對陰溝腸桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行定性檢測，改良三維試驗(yàn)檢測AmpC酶和超廣譜p．內(nèi)酰胺酶。接合傳遞實(shí)驗(yàn)及用特異性超廣譜p．內(nèi)酰胺酶引物對質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確

2、定產(chǎn)酶基因的位置及類型，對酶基因進(jìn)行DNA序列測定，分析同源性并對其進(jìn)行原核表達(dá)，IEF測定酶等電點(diǎn)及紫外分光光度法測定酶水解底物輪廓。設(shè)計并合成針對細(xì)菌p．內(nèi)酰胺酶基因的10-23脫氧核酶、反義寡核苷酸，采用氯化鈣法將其分別導(dǎo)入表達(dá)p．內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌中，觀察耐藥菌在導(dǎo)入脫氧核酶后在含p．內(nèi)酰胺類藥物的培養(yǎng)基中的生長情況及酶’表達(dá)量的變化。 結(jié)果 59株陰溝腸桿菌對AMP耐藥率最高為80．5％，最低為IMP的3．39

3、％，對其他10種藥物的耐藥率在20．34％～62．71％。Nitrocefin顯色證實(shí)43株(72．88％)產(chǎn)p．內(nèi)酰胺酶，三維試驗(yàn)檢測18株(30．05％)ESBLs表型陽性，11株(18．65％)AmpC酶表型陽性，其中5株(8．48％)ESBLs、AmpC表型均陽性。ESBLs表型陽性株均含一個約6kb的質(zhì)粒,PCR擴(kuò)增及DNA序列測定分析13株同時產(chǎn)CTX-M-22及廣譜酶TEM-1或TEM-141，3株產(chǎn)SHV型ESBLs(S

4、HV-5、SHV-12、SHV-70)，2株產(chǎn)TEM型ESBLs(TEM-28v、TEM-116v)，其中blasav-70與blasav-1l基因高度同源，其所推導(dǎo)的氨基酸序列與blasHv．11相比較僅有1個氨基酸殘基的差異，為一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)SHV型p-內(nèi)酰胺酶(GenBank登錄號：DQ013287)。表型鑒定SHV-70克隆菌株ESBLs陽性，而SHV-11為非ESBLs。等電聚焦電泳結(jié)果顯示SHV-70和SHV-11的pI均

5、為7．6。p．內(nèi)酰胺類藥物對SHV-70克隆菌株的MIC是SHV-11克隆菌株的4-8倍，SHV-70對p．內(nèi)酰胺類藥物的水解活性亦相應(yīng)增強(qiáng)了4-8倍。10-23脫氧核酶導(dǎo)入產(chǎn)TEM-1β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌后，在含氨芐西林(100gg／m1)LB培養(yǎng)基中脫氧核酶實(shí)驗(yàn)組大腸桿菌在不同時間點(diǎn)的生長(OD值)均明顯低于導(dǎo)入反義寡核苷酸或空白對照組，其產(chǎn)酶量亦明顯低于導(dǎo)入反義寡核苷酸或空白對照組。 結(jié)論 1．本地區(qū)臨床分離陰溝腸