院內(nèi)感染多重耐藥鮑曼不動桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的研究.pdf

1、鮑曼不動桿菌是引起醫(yī)院感染的重要病原菌，廣泛分布于自然界、醫(yī)院環(huán)境和人體皮膚表面，其分離率在非發(fā)酵菌中僅次于綠膿假單孢菌。在免疫力低下的患者中，可以引起導管相關性肺炎、敗血癥、泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎等嚴重的感染。隨著抗生素的廣泛使用，多重耐藥(同時耐3種以上不同類型的抗生素，如β-內(nèi)酰胺類、氨基糖甙類、氟喹喏酮類等)的鮑曼不動桿菌的比例逐年增加，在重癥監(jiān)護病房、血液病房引起的爆發(fā)流行病死率很高。研究發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥

2、的機制除外膜通透性的降低、外膜孔蛋白的丟失和主動外排等外，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是最主要的原因。由于院內(nèi)多重耐藥鮑曼不動桿菌感染在近年才被發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外對其耐藥性的研究均處于起步階段，對其產(chǎn)酶情況也僅有少量報到。因此，本研究以2004年4月～2004年9月從第三軍醫(yī)大學附屬西南醫(yī)院臨床標本中分離到的鮑曼不動桿菌多重耐藥菌株為研究對象，確定其耐藥譜，并采用PCR擴增其耐藥基因，通過基因測序和同源性分析了解其產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶情況。并對其中一株鮑曼不動桿

3、菌產(chǎn)生的AmpC型β-內(nèi)酰胺酶利用分光光度法進行了酶動力學及抑酶效應的研究。以期為臨床合理使用抗生素控制鮑曼不動桿菌感染提供實驗依據(jù)。 本研究分四部分進行： 1.鮑曼不動桿菌耐藥性的流行病學調(diào)查及產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的粗篩 2.院內(nèi)感染鮑曼不動桿菌β-內(nèi)酰胺酶PCR分析 3.鮑曼不動桿菌攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因測序及同源性比較 4.鮑曼不動桿菌04-565AmpC酶動力學及抑酶效應的研究 1.方法

4、 1.1藥物敏感性和產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶分析藥物敏感性采用K-B紙片法和瓊脂稀釋法；產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶情況用頭孢硝噻吩紙片檢測；復合紙片表型確證法粗篩產(chǎn)ESBLs菌株；三維實驗檢測其產(chǎn)AmpC酶的情況。 1.2產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶基因分析設計不同的β-內(nèi)酰胺酶針對性引物，分別以細菌的染色體和質(zhì)粒為模板，PCR分析確定產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶基因，并進行產(chǎn)物測序和同源性比較。 1.3β-內(nèi)酰胺酶動力學及酶抑制劑的抑酶效應鮑曼不動桿菌04-56

5、5AmpC酶動力學及抑酶效應采用分光光度法研究。 2.結果 2.1藥物敏感性41株鮑曼不動桿菌均對青霉素、頭孢哌酮、頭孢孟多酯鈉、頭孢曲松、頭孢噻肟和氨曲南等β-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)出高度耐藥；對四環(huán)素、氯霉素、利福平和紅霉素的耐藥率也較高；對美羅培南、亞胺培南等碳青霉烯類呈高敏感性；對左氧氟沙星等喹諾酮類相對敏感。 2.2產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶分析41株鮑曼不動桿菌中，頭孢硝噻吩紙片初步確定12株鮑曼不動桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺

6、酶。其中復合紙片表型確證法粗篩出04-195、04-537、04-573、04-145、045-238和04-165等6株細菌可能產(chǎn)ESBLs；三維實驗檢測出04-195、04-537、04-573、04-145、04-565、04-536及04-310等7株鮑曼不動桿菌產(chǎn)AmpC酶。 2.3鮑曼不動桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶基因的PCR分析PCR結果顯示，12株鮑曼不動桿菌的染色體和質(zhì)粒均攜帶有β-內(nèi)酰胺酶基因；采用10對針對性β-內(nèi)

7、酰胺酶引物的檢測發(fā)現(xiàn)，在04-195、04-537、04-145和04-573菌株的染色體上攜有blaTEM基因，在04-145、04-537、04-573、04-195、04-565和04-536的質(zhì)粒上攜有blaAmpC基因。將04-565菌株的耐藥質(zhì)粒成功轉化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，獲得與AmpC耐藥表型相符的轉化菌B1。 2.4部分菌株PCR產(chǎn)物測序和同源性比較04-565菌株質(zhì)粒以bla通用引物、04-195菌株染

8、色體以blaTEM引物和04-573菌株質(zhì)粒以blaAmpC引物獲得的PCR產(chǎn)物進行了基因測序及同源性分析，分別與Genbank上注冊號為56095.1的大腸埃希菌質(zhì)粒介導的AmpC酶、Genbank上注冊號為AF126482的腦膜炎雙球菌質(zhì)粒介導的TEM型β-內(nèi)酰胺酶和Genbank上注冊號為AJ009979.的鮑曼不動桿菌染色體介導的AmpC酶的同源性均為99％。 2.5轉化株B1所產(chǎn)AmpC酶的動力學及抑酶效應結果表明該A

9、mpC酶對頭孢哌酮、頭孢孟多和頭孢替唑鈉的親和力較低、水解效率較高，相應的Km及Vmax/Km值大于對苯唑西林、頭孢呋辛、頭孢他啶及拉氧頭孢的Km及Vmax/Km值。此外，克拉維酸和舒巴坦2種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑對AmpC酶的抑制效力均較差，尤其是克拉維酸作用很弱。 3.結論 3.1我院臨床分離的鮑曼不動桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素高度耐藥，對碳青霉烯類抗生素高度敏感。 3.2產(chǎn)AmpC酶、ESBLs是我院鮑曼不動桿菌