超順磁性殼聚糖質(zhì)粒（pDsVEGF-,165-Red1-N1）明膠控釋微球促進人工骨血管化的初步研究.pdf

1、目的：制備超順磁性殼聚糖質(zhì)粒明膠微球(SPCPGM)，將其與生物活性人工骨復(fù)合，在體外觀測SPCPGM在外磁場(靜磁場和／或振蕩磁場)的作用下控釋、濃聚質(zhì)粒的功能；在體內(nèi)觀測SPCPGM在外磁場(靜磁場和／或振蕩磁場)下促進生物活性人工骨血管化及成骨的作用。評估振蕩磁場和／或靜磁場下SPCPGM促進人工骨血管化及成骨的效果，初步探討其臨床應(yīng)用價值。 方法：(1)用化學(xué)共沉淀法制備超順磁性殼聚糖納米球(SPFCN)，用掃描電鏡、紅

2、外光譜儀、X一光衍射儀、Zeta電勢分析儀和磁力天平對合成的SPFCN進行形貌觀察和結(jié)構(gòu)表征。(2)制備大量能夠在真核細胞中表達人VEGFl65(hVEGFi65)-紅色熒光融合蛋白(RFP)質(zhì)粒(pDsVEGFl65Redl．N1)。用SacII、HandIII雙酶切后行瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，并對質(zhì)粒進行DNA序列測定，用SmartSpecTM3000核酸蛋白測定儀測定其純度和濃度。(3)制備超順磁性殼聚糖質(zhì)粒(pDsVEGFl65

3、Redl—N1)復(fù)合物(SPCPN)。用瓊脂糖凝膠電泳考察其結(jié)合質(zhì)粒DNA的能力；用磁力天平測試其磁感應(yīng)性。通過在靜磁場下，人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC一1)和人成骨肉瘤細胞(MG-63)轉(zhuǎn)染實驗，用倒置熒光顯微鏡、流式細胞儀及原子吸收光譜儀測定，觀測靜磁場促進SPCPN細胞轉(zhuǎn)染的作用。(4)用交聯(lián)固化法制備超順磁性殼聚糖質(zhì)粒明膠微球(SPCPGM)、非磁性殼聚糖質(zhì)粒明膠微球(CPGM)和不含質(zhì)粒的超順磁性殼聚糖明膠微球(SPCGM)。

4、用納米羥基磷灰石／聚酰胺骨水泥(由四川大學(xué)納米生物材料研究中心提供)制備中空帶側(cè)孔的仿兔橈骨中段骨缺損修復(fù)支架，將一定量的三種微球分別填入中空支架中，在37℃下，用0．0lMPBS(pH7．4)溶劑行體外藥物釋放試驗，用振蕩磁場干預(yù)，用核酸蛋白測定儀測定質(zhì)粒的釋放量，觀測振蕩磁場促進SPCPGM中質(zhì)粒釋放的作用。用自制的塑料槽為溶出試驗容器，將含有一定量微球的支架固定于塑料槽中部。靜磁場下，在醋酸胃酶溶液中進行體外質(zhì)粒溶出試驗，研究靜磁

5、場局部濃聚質(zhì)粒的效果。(5)選用新西蘭大白兔48只，建立兔橈骨雙側(cè)骨缺損模型，隨機分為(A組)SPCPGM+靜磁場+振蕩磁場；(B組)SPCPGM+靜磁場；(C組)單純應(yīng)用SPCPGM；(D組)CPGM。術(shù)后2周、4周、6周、8周、12周、16周，搜集標本，通過大體觀察，缺損處影像學(xué)檢測，組織切片光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察，求積儀測量和計算機圖像分析系統(tǒng)分析等方法對缺損處新生血管和成骨情況進行定性及定量測定，將所獲得的

6、數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，以評估四種不同處理組新生血管及成骨的情況。 結(jié)果：(D掃描電鏡下Fe304納米粒外形呈圓形或橢圓形，均勻度好，粒徑范圍在7-20nm；SPFCN平均粒徑：46+24nm，氮含量為0．007mg／L。SPFCN表面帶正電荷(70．5+5．3mV)。磁力天平檢測結(jié)果顯示：SPFCN具有超順磁性質(zhì)。(2)質(zhì)粒(pDsVEGFj65Redl—N1)經(jīng)擴增、純化后，SacII、HandIII雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定

7、顯示：VEGF165片段大小與預(yù)期(573bp)相符，基因序列測定結(jié)果表明，基因序列正確。用SmartSpecTM3000核酸蛋白測定儀檢測質(zhì)粒濃度為0．3+0．05mg／ml。(3)用瓊脂糖凝膠電泳分析SPFCN完全結(jié)合質(zhì)粒(pDsVEGFl65Redl．N1)時的氮／磷(N／P)比例為2．5／1，組裝后SPCPN的Zeta電位為27．8+4mV，仍帶正電荷。(4)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC．1)和人成骨肉瘤細胞(MG-63)轉(zhuǎn)染實

8、驗顯示：在靜磁場下，轉(zhuǎn)染率分別為21．6％和9．35％，明顯高于裸質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率4．5％和3％。提示靜磁場能夠促進SPCPN的細胞轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染效率可提高3-5倍。(5)振蕩磁場下SPCPGM體外質(zhì)粒溶出實驗顯示：SPCPGM在多孔骨植入體中具有藥物緩釋功能，釋藥時間超過三周。振蕩磁場能夠增加多孔骨植入體中SPCPGM質(zhì)粒釋放速率，25天時使藥物釋放量提高到4-6倍。(6)靜磁場下SPCPGM中質(zhì)粒濃聚實驗顯示：200mT(毫特斯拉)的靜磁

9、場下，塑料槽內(nèi)溶出液中DNA濃度由內(nèi)向外呈梯度遞減分布，在3-5cm處DNA濃度有明顯遞減現(xiàn)象，與CPGM相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0．05)。(7)磁場(振動磁場和／或靜磁場)下SPCPGM促進人工骨血管化的體內(nèi)實驗研究表明：①SPCPGM與CPGM一樣具有促進體內(nèi)局部成血管及成骨作用，兩者效率相近。②靜磁場能夠促進SPCPGM體內(nèi)局部成血管及成骨作用，效果優(yōu)于單純使用SPCPGM或CPGM。③靜磁場和振動磁場聯(lián)合應(yīng)用，能夠明顯提高

10、SPCPGM體內(nèi)局部成血管及成骨作用，6周時成血管量達到最高峰并大量成骨。④振動磁場的應(yīng)用，能夠促使局部磁性微球殘留量的明顯減少，這對避免局部藥物殘留可能造成的近期或遠期的不良后果具有重要意義。⑤促進血管生成及成骨的效能依次為：SPCPGM+靜磁場+振蕩磁場>SPCPGM+靜磁場>磁性基因微球≈非磁性基因微球。 結(jié)論：1．納米Fe304殼聚糖具有超順磁性能，靜磁場下能夠濃聚質(zhì)粒DNA并能促進其轉(zhuǎn)染細胞：2．超順磁性殼聚糖質(zhì)粒(p