超順磁性殼聚糖質(zhì)粒（pAdTRACKBMP-,9-）明膠微球促進(jìn)骨缺損愈合的初步研究.pdf

1、目的：觀(guān)察振蕩磁場(chǎng)和/或靜磁場(chǎng)下填充超順磁性殼聚糖質(zhì)粒(pAdTRACKBMP9)明膠微球(SPCPGM)的生物活性人工骨促進(jìn)骨缺損愈合的作用，探討其成骨效果及其臨床應(yīng)用價(jià)值。 方法：(1)化學(xué)共沉淀法制備超順磁性殼聚糖納米微球(SPFCN)，用透射、掃描電鏡和振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)等儀器對(duì)合成的SPFCN進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察和結(jié)構(gòu)表征。(2)制備大量能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP9(hBMP9)的質(zhì)粒(pAdTRACKBMP9)。

2、用Pvu Ⅱ、Sal Ⅰ雙酶切后行瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定，用SmartSpecTM3000核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其純度和濃度。(3)制備超順磁性殼聚糖質(zhì)粒(pAdTRACKBMP9)復(fù)合物(SPCPN)。用瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)測(cè)超順磁性殼聚糖納米球(SPFCN)與質(zhì)粒(pAdTRACKBMP9)的結(jié)合能力。(4)用交聯(lián)固化法制備超順磁性殼聚糖質(zhì)粒明膠微球(SPCPGM)和不含質(zhì)粒的超順磁性殼聚糖明膠微球(SPCGM)。

3、用納米羥基磷灰石/聚酰胺骨水泥(由四川大學(xué)納米生物材料研究中心提供)制備中空帶側(cè)孔的仿兔橈骨中段骨缺損修復(fù)支架，將一定量的兩種微球分別填入中空支架中。(5)選用新西蘭大白兔60只，建立兔橈骨雙側(cè)骨缺損模型，隨機(jī)分為(A組)SPCPGM+振蕩磁場(chǎng)+靜磁場(chǎng)；(B組)SPCPGM+靜磁場(chǎng)；(C組)SPCGM+振蕩磁場(chǎng)+靜磁場(chǎng)；(D組)SPCGM；(E組)空支架。術(shù)后1周、2周、4周、6周、8周、12周，搜集標(biāo)本，通過(guò)大體觀(guān)察，X線(xiàn)影像學(xué)檢測(cè)，

4、組織切片光學(xué)顯微鏡觀(guān)察，求積儀測(cè)量和計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析等方法對(duì)缺損處成骨情況進(jìn)行定性及定量測(cè)定，將所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以評(píng)估五種不同處理組成骨的情況。 結(jié)果：(1)掃描電鏡下Fe304納米粒外形呈圓形或橢圓形，均勻度好，粒徑為23±2.47nm；氮含量為0.0053mg/L。振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果示制備的超順磁納米微球具有超順磁性。(2)質(zhì)粒(pAdTRACKBMP9)經(jīng)擴(kuò)增、純化后，PvuⅡ、Sal I雙酶切瓊脂糖

5、凝膠電泳分析鑒定顯示：BMP9片段大小與預(yù)期(1290 bp)相符，基因序列測(cè)定結(jié)果表明，基因序列正確。用SmartSpec(TM)3000核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)質(zhì)粒濃度為1.13±0.07m/ml。(3)用瓊脂糖凝膠電泳分析 SPFCN與質(zhì)粒(pAdTRACKBMP9)結(jié)合時(shí)的最適氮/磷(N/P)比例為2.5/1。(4)磁場(chǎng)(振動(dòng)磁場(chǎng)和/或靜磁場(chǎng))下SPCPGM促進(jìn)人工骨成骨的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明：①SPCPGM具有明顯的促進(jìn)體內(nèi)局部成骨的作

6、用。②靜磁場(chǎng)能夠促進(jìn)SPCPGM體內(nèi)局部成骨作用，效果優(yōu)于使用SPCGM。③靜磁場(chǎng)和振動(dòng)磁場(chǎng)聯(lián)合應(yīng)用，能夠明顯提高SPCPGM體內(nèi)局部成骨作用，4周時(shí)已有大量成骨。④促進(jìn)成骨的作用的順序：1)SPCPGM+振蕩磁場(chǎng)+靜磁場(chǎng)；2)SPCPGM+靜磁場(chǎng)；3)SPCGM+振蕩磁場(chǎng)+靜磁場(chǎng)；4)SPCGM；5)空支架。⑤振動(dòng)磁場(chǎng)的應(yīng)用，能夠促使局部磁性微球殘留量的明顯減少，這對(duì)避免局部藥物殘留可能造成的近期或遠(yuǎn)期的不良后果具有重要意義。