振蕩磁場(chǎng)促超順磁性明膠質(zhì)粒(pDsVEGF-,165-Red1-N1)微球的制備及體內(nèi)活性的初步研究.pdf

1、目的：制備超順磁性殼聚糖質(zhì)粒明膠微球（SPCPGM），在體外研究不同磁場(chǎng)強(qiáng)度、不同頻率的脈沖振蕩磁場(chǎng)作用下，與質(zhì)粒（pDsVEGF165Red1-N1）基因釋放的量效關(guān)系。初步在體內(nèi)進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)研究，為超順磁性明膠載藥微球的體內(nèi)研究及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：（1）用化學(xué)共沉淀法制備超順磁性四氧化三鐵殼聚糖納米粒（SPFCN），用透射電鏡、X-射線衍射儀、Zeta電位分析儀和振動(dòng)樣品磁場(chǎng)計(jì)等對(duì)制備的SPFCN進(jìn)行形態(tài)觀察和結(jié)

2、構(gòu)表征。（2）制備大量能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)人VEGF165的質(zhì)粒（pDsVEGF165Red1-N1）。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定，用SmartSpecTM3000核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度。（3）制備超順磁性四氧化三鐵殼聚糖納米粒質(zhì)粒（pDsVEGF165Red1-N1）復(fù)合物。（4）用交聯(lián)固化法制備超順磁性四氧化三鐵殼聚糖質(zhì)粒明膠微球（SPCPGM）和超順磁性殼聚糖明膠微球（SPCGM）。用納米羥基磷灰石/聚酰胺骨水泥（由四川大學(xué)納米生

3、物材料研究中心提供）制備中空帶側(cè)孔的仿兔橈骨中段骨缺損修復(fù)支架。將一定量的兩種微球分為（A組）SPCPGM+振蕩磁場(chǎng)，（B組）非磁性的SPCPGM+振蕩磁場(chǎng)，（C組）SPCGM+中空支架+振蕩磁場(chǎng)，其中A組和B組的微球包于雙層紗布中，C組的微球裝于支架中；在37℃下，用溶出度測(cè)定儀的轉(zhuǎn)藍(lán)法測(cè)質(zhì)粒的釋放度，采用模擬人工體液（pH7.4）介質(zhì)進(jìn)行體外藥物釋放試驗(yàn)，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定質(zhì)粒的釋放量。（5）選用新西蘭大白兔48只，建立兔橈骨雙側(cè)

4、骨缺損模型，隨機(jī)分為（A組）SPCPGM+中空支架+振蕩磁場(chǎng)，（B組）SPCPGM+中空支架，（C組）SPCGM+中空支架+振蕩磁場(chǎng)；術(shù)后2周、4周、6周、8周、12周，搜集標(biāo)本，通過(guò)大體觀察，生血管情況進(jìn)行定性及定量測(cè)定，以評(píng)估三種不同處理組促進(jìn)新生血管的情況。 結(jié)果：（1）透射電鏡下Fe3O4納米粒外形呈圓形或橢圓形，均勻度好，粒徑小于30nm；氮含量為0.0058mg/L。SPFCN表面帶正電荷（69.8±5.1mV）。振

5、動(dòng)樣品磁場(chǎng)計(jì)結(jié)果顯示：SPFCN具有超順磁性。（2）質(zhì)粒（pDsVEGF165Red1-N1）經(jīng)擴(kuò)增、純化后，用瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定顯示：VEGF165片段大小與預(yù)期的相符，基因序列測(cè)定結(jié)果表明，基因序列正確。用SmartSpecTM3000核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)質(zhì)粒濃度為0.28±0.05 mg/ml。（3）復(fù)合后的SPCPN Zeta電位為26.7±4mV，仍帶正電荷。（4）振蕩磁場(chǎng)下SPCPGM體外質(zhì)粒釋放實(shí)驗(yàn)顯示：SPCPGM具有

6、藥物緩釋功能，釋藥時(shí)間超過(guò)三周。振蕩磁場(chǎng)能夠促進(jìn)SPCPGM質(zhì)粒釋放的速率，25天時(shí)使藥物釋放量提高到3倍。 結(jié)論：振動(dòng)磁場(chǎng)下SPCPGM促進(jìn)人工骨血管化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明：①SPCPGM具有促進(jìn)體內(nèi)局部成血管及成骨作用，而SPCGM幾乎沒(méi)有這個(gè)作用。②振動(dòng)磁場(chǎng)的應(yīng)用，能夠明顯提高SPCPGM體內(nèi)局部成血管及成骨的作用，4周時(shí)成血管量達(dá)到最高峰，6周有大量的骨長(zhǎng)成。③促進(jìn)血管生成及成骨的效能依次為：SPCPGM+中空支架+振蕩磁