成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞致瘤性的分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、最近研究表明，成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)干細(xì)胞，并且成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞具有和自身腦源性神經(jīng)干細(xì)胞相似的生物學(xué)特征。成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞的應(yīng)用可以避免諸如取材困難、免疫排斥及倫理學(xué)問題等困擾著腦源性、及胚胎源性神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用所遇到的各種難題。骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞自身具有的特征及優(yōu)勢使其在應(yīng)用成體干細(xì)胞治療人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病及損傷方面具有良好的臨床應(yīng)用前景。然而，在臨床應(yīng)用前對于成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞在移植后的長期安全性問題

2、是一有待深入探索的研究課題之一。 致瘤性是成體干細(xì)胞臨床應(yīng)用安全性方面一個重要的關(guān)注問題。有研究表明，體外培養(yǎng)的小鼠源性的骨萌基質(zhì)細(xì)胞可表現(xiàn)出快速增殖、失去接觸抑制及異常的細(xì)胞核表型改變等生物學(xué)特征，并且在將這些細(xì)胞移植于裸鼠或同系基因型的免疫缺陷小鼠體內(nèi)后可導(dǎo)致腫瘤生成。再者，干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞有著很多相似的特征，有一理論假說認(rèn)為腫瘤細(xì)胞中包含了少量被稱為腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞，它們有著無限的自身增殖能力，并且可以導(dǎo)致腫瘤形成。因而，

3、對臨床應(yīng)用的干細(xì)胞的致瘤性研究顯得非常重要。目前為止，并沒有明確的證據(jù)證明成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞不存在致瘤性的可能。而對于成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞的致瘤性問題，在前期工作中我們進(jìn)行了染色體分析、體外凝集試驗(yàn)以及裸鼠成瘤試驗(yàn)等一系列研究，發(fā)現(xiàn)成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞染色體形態(tài)、數(shù)目及結(jié)構(gòu)正常，體外無凝集反應(yīng)，接種裸鼠6個月無腫瘤形成，為評價其致瘤性提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。我們認(rèn)為，對于成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞的致瘤可能性不能僅依據(jù)體外實(shí)驗(yàn)或動物實(shí)

4、驗(yàn)而完全排除，因?yàn)槌扇斯撬柙葱陨窠?jīng)干細(xì)胞在人體內(nèi)的生長條件和在培養(yǎng)皿中或動物體內(nèi)存在很大的區(qū)別。在移植之后，成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞在人體內(nèi)可能存在一段難以估計(jì)的較長時期，在這段時期其可能發(fā)生很多變化，因而對于成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞在人體內(nèi)是否會發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變目前仍然還不能確定。對移植前的成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞的致瘤性進(jìn)行研究，能為評估其在移植后于人體內(nèi)長期存在的過程中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的風(fēng)險提供有意義的參考依據(jù)。 因?yàn)橹铝鲂钥蓺w因于遺傳

5、異常，在本研究中我們對成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞中數(shù)百個腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行分析，目的是為了明確該細(xì)胞中是否存在某些基因特征可以有助于對其致瘤性的評價。 第一章：成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞的獲得與鑒定 目的：建立一種快速有效的由成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞方法，并從細(xì)胞形態(tài)、標(biāo)志性蛋白的表達(dá)及體外誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)系細(xì)胞的能力等方面對成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行檢測。 材料與方法： 抽取正常成

6、人志愿者全骨髓，應(yīng)用密度梯度離心法分離成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞，體外培養(yǎng)純化及擴(kuò)增成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞，以神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)培養(yǎng)成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞成為成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞，以誘導(dǎo)培養(yǎng)基于體外誘導(dǎo)培養(yǎng)成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)系細(xì)胞分化。相差顯微鏡下觀察成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞及成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；免疫組化法檢測成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞中神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Nestin的表達(dá)，以及由成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后得到的神經(jīng)系細(xì)胞中神經(jīng)

7、膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白GFAP、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白NG2及神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白MAP2ab的表達(dá)。 結(jié)果： 傳代純化后的成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長，呈梭形，貼壁生長，增殖旺盛，幾乎不表達(dá)Nestin。經(jīng)10~15天誘導(dǎo)培養(yǎng)，成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞，成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞由細(xì)胞克隆聚集成神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)，不貼壁生長，增殖旺盛，高度表達(dá)Nestin。經(jīng)7～10天誘導(dǎo)培養(yǎng)，成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞體外分化成神經(jīng)系細(xì)胞

8、，細(xì)胞可表達(dá)GFAP、NG2及MAP2ab。 結(jié)論： 1.成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞可在體外快速誘導(dǎo)分化成為成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞。 2.成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞具有神經(jīng)分化的能力，在體外可進(jìn)一步誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞類型。 3.成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞可為成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞提供豐富的細(xì)胞來源。 第二章：成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞中重要抑癌基因的突變檢測 目的：對成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞中重要抑癌基因p53

9、、Rb1和p16基因的常見突變點(diǎn)進(jìn)行序列分析，觀察是否存在異常的突變現(xiàn)象，從抑癌基因水平研究成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞的致瘤性問題。 材料與方法： 提取成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞的基因組DNA，應(yīng)用PCR-DNA測序技術(shù)，設(shè)計(jì)特定PCR引物，PCR擴(kuò)增成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞p53基因第5～9外顯子、Rb1基因第19～21外顯子以及p16基因第1~2外顯子，并對擴(kuò)增片段進(jìn)行DNA測序。 結(jié)果： 成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)

10、胞中p53基因第5～9外顯子、Rb1基因第19~21外顯子以及p16基因第l~2外顯子的序列均與野生型一致，未見突變現(xiàn)象。 結(jié)論： 由成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)形成的成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)重要抑癌基因的常見突變現(xiàn)象，此結(jié)果為評價成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞體內(nèi)移植的致瘤性提供了有意義的參考依據(jù)。 第三章：成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞中腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)檢測 目的：檢測成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞中腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)

11、情況，為評價其移植后的致瘤性提供依據(jù)。 材料與方法： 實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)組：成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞；對照組：新鮮正常成人骨髓細(xì)胞去紅細(xì)胞。提取總RNA；以腫瘤基因芯片OligoGEArrayHumanCancerMicroarrayOHS-802檢測成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞中440個腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)水平；以實(shí)時定量RT-PCR的方法對成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞中基因芯片檢測結(jié)果顯示呈高度表達(dá)的部分重要癌基因進(jìn)行檢測。 結(jié)

12、果： 基因芯片檢測結(jié)果顯示，與新鮮正常成人骨髓細(xì)胞去紅細(xì)胞相比較，成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞中有66個腫瘤相關(guān)基因呈高度表達(dá)(>3倍)，呈高度表達(dá)的基因中包含了促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移及一些重要致癌性信號傳導(dǎo)通路的成員等基因。實(shí)時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與新鮮正常成人骨髓細(xì)胞去紅細(xì)胞相比較，所檢測的癌基因MYC、MMP2、Notch2、STC1、ITGA3、STAT5b、RhoC及Wnt1在成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞中均呈

13、高度表達(dá)，與基因芯片檢測的結(jié)果相符，其表達(dá)倍數(shù)分別是：MYC(4.35×100)、MMP2(2.84×100)、Notch2(2.87×100)、STC1(3.41×102)、ITGA3(2.22×102)、STAT5b(6.99×100)、RhoC(4.92×100)、Wnt1(3.64×100)。 結(jié)論： 1.成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞中存在大量的腫瘤相關(guān)基因的高度表達(dá)，其可能的生物學(xué)意義有待進(jìn)一步深入研究。 2