未折疊蛋白反應(yīng)在白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制中作用的實驗研究.pdf

1、目的: 自1972年Kerr首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡以來，有關(guān)細(xì)胞凋亡與白內(nèi)障的關(guān)系一直在探討中。目前認(rèn)為晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡是除先天性白內(nèi)障以外所有類型白內(nèi)障形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。研究晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡機(jī)制成為研究各型白內(nèi)障形成機(jī)制的熱點。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊的場所，在低氧、葡萄糖饑餓、氧化及糖基化作用紊亂等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)刺激因子作用下，大量未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積，產(chǎn)生一條稱為未折疊蛋白反應(yīng)的自我保護(hù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，應(yīng)激信號通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)傳送進(jìn)

2、入細(xì)胞核中，最終使細(xì)胞產(chǎn)生生存適應(yīng)或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此未折疊蛋白反應(yīng)在應(yīng)激細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸中起重要作用。本課題通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激因子作用于晶狀體上皮細(xì)胞，試圖了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的未折疊蛋白反應(yīng)是否誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡，從而探討未折疊蛋白反應(yīng)與白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。 方法: 將晶狀體上皮細(xì)胞分為對照組和實驗組A、B、C、D組，分別用0、1、2、5、10mmol/L的同型半胱氨酸(Hcy)作用于細(xì)胞24小時。應(yīng)用MTT法檢測不

3、同濃度藥物刺激后的細(xì)胞增殖抑制率；應(yīng)用Hoechst33258熒光染色檢測細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用活性氧熒光探針DCFH-DA檢測刺激后細(xì)胞中活性氧產(chǎn)物(ROS)；應(yīng)用GSH檢測試劑盒檢測刺激后細(xì)胞中還原型谷胱甘肽(GSH)的含量；應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測刺激后細(xì)胞中的GRP78，caspase-12的表達(dá)。 結(jié)果: 1.不同濃度同型半胱氨酸對細(xì)胞增殖抑制率的影響：Hcy刺激細(xì)胞24h后，顯微鏡下可見對照組、實驗A、

4、B組細(xì)胞均貼壁生長，形態(tài)無明顯變化；實驗C、D組細(xì)胞可見部分漂浮，其中D組細(xì)胞貼壁少，細(xì)胞死亡過半。細(xì)胞活力呈濃度依賴性下降，其中5mmol/L，10mmol/LHcy可使細(xì)胞活性下降48.3％，57.7％，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 2.不同濃度同型半胱氨酸對細(xì)胞凋亡的影響：熒光顯微鏡下可見對照組與實驗A、B組細(xì)胞無明顯凋亡發(fā)生，核呈彌散均勻的藍(lán)色熒光，實驗C組細(xì)胞體積縮小，核凝聚變小，核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃

5、染致密的顆粒塊狀熒光，且熒光強(qiáng)度比正常細(xì)胞要強(qiáng)。實驗D組由于細(xì)胞貼壁少，無熒光結(jié)果顯示。 3.不同濃度同型半胱氨酸對細(xì)胞內(nèi)ROS形成的影響：熒光顯微鏡下可見，對照組細(xì)胞基本無熒光顯現(xiàn)，實驗組均可見綠色熒光，且熒光強(qiáng)度呈濃度依賴性增加。流式細(xì)胞儀檢測的細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度的變化經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析表明，與對照組相比，實驗A、B組的ROS水平的升高無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而實驗C、D組的ROS水平顯著升高(P<0.05)。 4

6、.不同濃度同型半胱氨酸對細(xì)胞內(nèi)GSH的影響：細(xì)胞內(nèi)的GSH含量隨刺激濃度的增加呈濃度依賴性減少。實驗A、B組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；實驗C、D組GSH顯著減少(P<0.05)。 5.細(xì)胞內(nèi)GRP78，caspase-12的表達(dá)：實驗組C、D組GRP78蛋白含量較對照組明顯增加，分別為對照組的4.6倍和6.9倍，同時伴隨Caspase-12表達(dá)增加，分別為對照組的2.8倍和3.1倍(P<0.05)；而實驗組

7、A、B各指標(biāo)雖有類似趨勢但變化程度較小，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論: 1.Hcy可誘發(fā)晶狀體上皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。 2.低濃度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)刺激因子會干擾晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，影響蛋白正確修飾與折疊，異常蛋白增多，但通過未折疊蛋白反應(yīng)的保護(hù)作用，細(xì)胞中的未折疊蛋白得以清除，細(xì)胞產(chǎn)生生存適應(yīng)。 3.高濃度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)刺激因子可刺激晶狀體上皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并通過未折疊蛋白反應(yīng)導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞