萘性白內(nèi)障的氧化機(jī)制及液體純牛奶對(duì)其作用研究.pdf

1、第一部分，萘性白內(nèi)障的氧化損傷機(jī)制及Ⅱ在氧化損傷中的作用
　　目的：通過萘性白內(nèi)障氧化損傷及鈣蛋自酶活性的研究,并結(jié)合萘性白內(nèi)障a晶狀體蛋白翻譯后修飾及分子伴娘活性的探討,揭示鈣蛋白酶丁II在白內(nèi)障氧化損傷中的作用及萘性白內(nèi)障作為年齡相關(guān)性白內(nèi)障的可靠性及可行性,為進(jìn)一步的研究打下了基礎(chǔ)。材料與方法：30只150g魄雌性SD大鼠被隨機(jī)分成2組:對(duì)照組、萘組。每周進(jìn)行裂隙燈照相及灰度分析;第9周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行血漿及晶狀體中還原型谷胱

2、甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)及細(xì)胞內(nèi)外鈣離子的檢測(cè);通過HPLC法進(jìn)行晶狀體勻漿的蛋白分離獲得a晶狀體蛋白,將a晶狀體蛋白通過雙向電泳進(jìn)一步分離,然后通過MALDI-TOF-TOF系統(tǒng)進(jìn)行雙向電泳上位點(diǎn)的鑒定及翻譯后修飾分析:通過a晶狀體蛋白抑制BL-晶狀體蛋白凝聚反應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)a晶狀體蛋白的分子伴娘活性強(qiáng)弱,并通過酪蛋白的水解程度判斷鈣蛋白酶II活性的變化。結(jié)果：從第3周開始,萘組晶狀體皮質(zhì)灰度明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

3、＜0.01),萘組晶狀體核灰度值自第3周起亦稍微高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。第9周時(shí),萘組晶狀體上皮細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01):萘組血漿及晶狀體中GSH水平低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);而MDA明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);萘組細(xì)胞內(nèi)外鈣離子水平明顯高于對(duì)照組,鈣蛋白酶活性明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)

4、研究鑒定出了a晶狀體蛋白的氧化、乙?；?、磷酸化、氨基甲?；?、甲基化等翻譯后修飾,并且在萘組鑒定出了C-端斷裂位點(diǎn):另外,我們的數(shù)據(jù)亦表明,萘組程晶狀體蛋白分子伴娘活性明顯降低,和對(duì)照組相比,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論：本研究相對(duì)系統(tǒng)的報(bào)道了萘性白內(nèi)障大鼠大體及組織細(xì)胞學(xué)損傷及晶狀體蛋白的翻譯后修飾的變化,并通過鈣蛋白酶活性的研究證實(shí)了鈣蛋白酶II的活性升高在萘性白內(nèi)障的氧化損傷中起到重要作用,從而在一定程度上證明了萘性自內(nèi)

5、障是一種可靠的、可重復(fù)性較好的年齡相關(guān)性白內(nèi)障模型,為進(jìn)一步的研究打下了基礎(chǔ)。
　　第二部分，鈣蛋白酶Ⅱ在萘醌誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷中的作用及其分子機(jī)制
　　目的：進(jìn)一步探討氧化損傷條件下,鈣蛋白酶II活性增強(qiáng)的原因及對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的影響。材料與方法：將永生性人晶狀體上皮細(xì)胞系SRAOI/04分三組:A組:對(duì)照組、B組:萘醌組、C組:萘醌+E64D組。分12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn),流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況;熒光探

6、針DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞中活性氧的變化;共聚焦顯微鏡觀察與分析氧化損傷對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響;免疫組化及Westernb10t法分析鈣蛋白酶II在細(xì)胞內(nèi)的分布與蛋白水平的表達(dá),RealTime-PCR法檢測(cè)鈣蛋白酶II在mRNA水平的表達(dá);通過Westernblot法分析作為鈣蛋白酶II的底物的aB-晶狀體蛋白量的變化,間接反應(yīng)鈣蛋白酶II的活性。結(jié)果：三個(gè)時(shí)間點(diǎn)萘醌組及萘醌+E64D組晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡率均明顯高于對(duì)照組,萘醌組晶狀體上

7、皮細(xì)胞的凋亡率明顯高于萘醌+E64D組;除處理后的第12小時(shí)萘醌+E64D組細(xì)胞中活性氧水平與對(duì)照組無明顯差別外,其他兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)萘醌組及萘醌+E64D組晶狀體上皮細(xì)胞中活性氧的水平明顯高于對(duì)照組,三個(gè)時(shí)間點(diǎn),萘醌組晶狀體上皮細(xì)胞中活性氧的水平明顯高于萘醌+E64D組:除處理后的第12小時(shí)萘醌+E64D組細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度與對(duì)照組無明顯差別外,其他兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)萘醌組及萘醌十E64D組細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度明顯于對(duì)照組,而三個(gè)時(shí)間點(diǎn),萘醌+E64

8、D組細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度略低于萘醌組;三個(gè)時(shí)間點(diǎn),鈣蛋白酶II蛋白質(zhì)及mRNA水平的表達(dá)量為萘醌組＞萘醌+E64D組＞對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。而aB晶狀體蛋白的量的變化為對(duì)照組＞萘醌+E64D組＞萘醌組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜O.01)。結(jié)論：本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了萘醌對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的氧化損傷在一定程度上與鈣蛋白酶II表達(dá)量的增加及活性增強(qiáng)有關(guān),而鈣蛋白酶抑制劑E64D可抑制鈣蛋白酶Il的表達(dá)及鈣蛋白酶的活性,從而對(duì)氧

9、化損傷具有一定的保護(hù)作用。
　　第三部分液體純牛奶對(duì)萘性白內(nèi)障的影響及作用機(jī)制
　　目的：探討液體純牛奶對(duì)萘性白內(nèi)障的影響及可能的作用機(jī)制。材料與方法：90只150g雌性SD大鼠被隨機(jī)分成6組:對(duì)照組、正常量牛奶組、過量牛奶組、萘組、萘加正常牛奶組、萘加過量牛奶組。每周進(jìn)行裂隙燈照相及灰度分析,第9周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行血漿及晶狀體中的半乳糖、鈣離子、氧自由基(ROS)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)測(cè)量。結(jié)果：皮質(zhì)灰

10、度方面,從第3周開始,萘加過量牛奶組晶狀體皮質(zhì)繞核區(qū)灰度明顯高于萘組,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,萘加正常牛奶組繞核區(qū)灰度和萘組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從第8周開始,過量牛奶組皮質(zhì)灰度稍過于對(duì)照組,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,正常牛奶組晶狀體皮質(zhì)灰度與對(duì)照組相比差別無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。核灰度方面,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,正常牛奶組及過量牛奶組與對(duì)照組之間及正常牛奶加萘組與萘組之間灰度差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從第3周開始,萘加過量牛奶組晶狀體核灰度值高于其它各組。第9周時(shí),過量牛奶組血漿及晶

11、狀體中ROS略高于對(duì)照組,而正常牛奶組血漿及晶狀體中ROS水平與對(duì)照組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;萘加過量牛奶組血漿及晶狀體中RoS明顯高于萘組,而萘加正常牛奶組血漿晶狀體中ROS水平與萘組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。過量牛奶組血漿及晶狀體中GSHIE略低于對(duì)照組,而正常牛奶組血漿晶狀體中GSH水平與對(duì)照組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;萘加過量牛奶組血漿及晶狀體中GSH明顯低于萘組,而萘加正常牛奶組血漿晶狀體中GSH水平與萘組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。過量牛奶

12、組血漿及晶狀體中MDA略高于對(duì)照組,而正常牛奶組血漿及晶狀體中MDA水平與對(duì)照組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;萘加過量牛奶組血漿及晶狀體中MDA明顯高于萘組,而萘加正常牛奶組血漿晶狀體中MDA水平與萘組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。過量牛奶組血漿中Ca2+濃度略高于對(duì)照組,但差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.08),該組房水及晶狀體中Ca2+濃度與對(duì)照組相比差別亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;萘組血漿、房水及晶狀體Ca2+明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)論：本研究通過灰