靶向治療藥物對(duì)骨髓瘤細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的和意義:多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,雖然迄今為止仍然難以治愈,但是近年來出現(xiàn)的一些新的靶向治療藥物在部分MM尤其是對(duì)常規(guī)化療藥物耐藥的患者中取得了令人滿意的療效。其中蛋白酶體抑制劑(PI)硼替佐米由于其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的高度特異性殺傷性及其相對(duì)較輕的副作用已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于臨床,并且也顯示了可喜的療效。眾所周知,硼替佐米通過特異性地抑制26S蛋白酶體對(duì)IκB的降解,進(jìn)而阻斷了NF-κB的

2、激活而發(fā)揮抗骨髓瘤活性。但這是否能完全解釋PI高度選擇性的抗骨髓瘤活性呢? 先前有學(xué)者報(bào)道蛋白酶體抑制劑(硼替佐米)與直接抑制NF-κB的藥物(包括特異性IκB激酶抑制劑PS-1145或不可逆的IκBα磷酸化抑制劑BAY11-7082)相比,具有更顯著的抗骨髓瘤細(xì)胞增殖的能力。這提示我們蛋白酶體抑制劑選擇性的抗骨髓瘤增殖效應(yīng)不單純是抑制NF-κB的結(jié)果,其中一定還有其它的機(jī)制在發(fā)揮作用。 MM細(xì)胞與正常的漿細(xì)胞一樣,產(chǎn)生大量的需

3、要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)處理的分泌性免疫球蛋白,這些免疫球蛋白的合成過程中必然伴隨著錯(cuò)誤折疊蛋白的出現(xiàn),包括有缺陷的核糖體產(chǎn)物等需要泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的降解。如果蛋白酶體的功能受到抑制必然影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解(ERAD),影響了錯(cuò)誤折疊蛋白由ER腔向胞質(zhì)的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(retrograde translocation),造成錯(cuò)誤折疊蛋白在ER腔的累積引發(fā)ER應(yīng)激(ERS)并激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR),而持續(xù)或過度UPR,就可以導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。因此

4、MM細(xì)胞必定對(duì)于PI引發(fā)的ERAD受阻異常敏感。先前也有報(bào)道聯(lián)合應(yīng)用PI與增加ER壓力的藥物如衣霉素(Tunicamycin)具有明顯的協(xié)同作用,可顯著增強(qiáng)對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng),這也從側(cè)面提示PI對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)可能與UPR密切相關(guān)。但是蛋白酶體抑制劑究竟是如何影響MM細(xì)胞中的UPR還需要進(jìn)一步深入的研究。 另外一個(gè)靶向治療藥物2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)為雌二醇的生理代謝產(chǎn)物,具有

5、抗多種腫瘤的活性,目前已應(yīng)用于臨床Ⅱ期試驗(yàn)中。我們先前實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)低劑量2ME2(0.1μmol/L-0.5μmol/L)可誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞向成熟階段分化,表現(xiàn)為細(xì)胞向成熟漿細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變,細(xì)胞表面分化抗原CD49e的表達(dá)上調(diào),分泌的免疫球蛋白也增多。已有研究證實(shí)UPR在B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化過程當(dāng)中發(fā)揮著重要作用,保證只有正確折疊的抗體才能由漿細(xì)胞內(nèi)分泌出來。轉(zhuǎn)錄因子XBP-1通過UPR途徑介導(dǎo)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化。我們發(fā)現(xiàn)2ME2誘導(dǎo)骨髓瘤

6、細(xì)胞分化的過程中,XBP-l的確是上調(diào)的,并且是由其上游調(diào)控基因PRDM1的上調(diào)解除了轉(zhuǎn)錄因子PaX-5對(duì)XBP-1的抑制實(shí)現(xiàn)的,提示PRDM1--漿細(xì)胞分化階段的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在UPR中也發(fā)揮著重要作用。最近學(xué)者Doody等也提出PRDM1也是UPR的靶基因之一,B細(xì)胞中UPR激活后PRDM1mRNA表達(dá)水平迅速上調(diào)。 PRDM1為PRDM基因家族成員,該家族在腫瘤發(fā)生中存在著特殊的陰陽(yáng)作用機(jī)制,即包含或缺失PR結(jié)構(gòu)域的兩種

7、同源異構(gòu)體分別發(fā)揮抑癌基因和癌基因的作用。那么在2ME2誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞分化的過程中對(duì)PRDM1兩種同源異構(gòu)體(包含PR結(jié)構(gòu)域的PRDM1α和缺失PR結(jié)構(gòu)域的PRDMI1β)表達(dá)的影響如何及其是否能夠與陰陽(yáng)作用機(jī)制相吻合就需要進(jìn)一步研究。 研究方法和結(jié)果： 一、以三個(gè)MM細(xì)胞系KM3、RPMI-8226和NCI-H929作為研究對(duì)象,首先采用MTT法檢測(cè)BZ作用后的細(xì)胞活力,計(jì)算各個(gè)細(xì)胞系的IC50濃度。然后分別采用熒光實(shí)

8、時(shí)定量PCR及Western-blot方法,對(duì)在UPR中發(fā)揮重要作用的靶基因GRP78/BiP和XBP-1兩種同源異構(gòu)體(XBP-1u、XBP-1s)在硼替佐米作用不同時(shí)相(0h、4h、12h、24h)的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的骨髓瘤細(xì)胞系對(duì)BZ敏感性差異顯著,KM3、RPM18226和NCI-H929的IC50分別為420.3073nM、129.083nM和70.913nM。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示三個(gè)MM細(xì)胞系中,BiP-

9、mRNA水平均隨作用時(shí)間逐漸上升,12h達(dá)到高峰,在KM3、RPM18226和NCI-H929中分別由0.209±0.024上升至0.350±0.015(p<0.05)、0.365±0.124上升至2.175±0.175(p<0.05)、0.324±0.016上升至2.235±0.355(p<0.05),BiP-mRNA表達(dá)水平在BZ作用后顯著上升。BiP蛋白表達(dá)水平亦均隨作用時(shí)間逐漸上升,24h達(dá)到高峰,在KM3、RPM18226和N

10、CI-H929中BiP蛋白表達(dá)量分別為基礎(chǔ)表達(dá)量的0.92～1.73、1.46～2.68、1.17～1.80倍,但差異不顯著。BZ處理后4h XBP-1u-mRNA即明顯增加,而XBP-ls mRNA則顯著下降；對(duì)XBP-1u/XBP-1s比值進(jìn)行了標(biāo)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BZ處理后4h XBP-1u/XBP-1s比值顯著上升,在KM3、RPM18226和NCI-H929中分別由基礎(chǔ)比值1.22±0.04上升至8.17±2.03(p<0.05)、

11、5.64±2.00上升至34.23±10.03(p<0.05)、3.10±0.24上升至7.56±1.76(p<0.05)。Westem-blot結(jié)果顯示BZ處理前后XBP-1總蛋白表達(dá)水平無顯著變化,在KM3、RPM18226和NCI-H929中XBP-1總蛋白表達(dá)量分別為基礎(chǔ)表達(dá)量的0.76±1.23、0.77～1.43、0.70～1.41倍。 二、以人MM細(xì)胞系NCI-H929、RPMl8226、KM3和LP-1作為研究對(duì)

12、象,采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)低劑量(終濃度0.5μmol/L)作用48h和72h時(shí)PRDM1α和PRDM1β的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低劑量2ME2處理后,在4個(gè)骨髓瘤細(xì)胞系中均出現(xiàn)PRDM1基因表達(dá)上調(diào),通過與內(nèi)參GAPDH的拷貝數(shù)進(jìn)行標(biāo)化,發(fā)現(xiàn)兩種同源異構(gòu)體的表達(dá)水平隨著2ME2的作用時(shí)間均有不同程度的增加,并且α/β比值隨著2ME2的作用時(shí)間顯著上升,在NCI-H929、RPM18226、KM3和LP-1中分別由基礎(chǔ)比值1.461±0

13、.033上升至作用72h時(shí)的2.663±0.38 1(p<0.01)、1.929±0.334上升至2.727±0.362(p<0.05)、1.471±0.012上升至4.367±0.243(p<0.001)、1.660±0.042上升至3.05±0.167(p<0.001)。 結(jié)論： 一、不同的骨髓瘤細(xì)胞系對(duì)BZ敏感性不同,MM細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的需要ER處理的分泌性免疫球蛋白愈多,對(duì)于PI造成的ERAD受阻就越敏感,細(xì)胞內(nèi)UP

14、R程度就愈高,就更易于發(fā)生凋亡,細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白量與其對(duì)PI的敏感性成正相關(guān)。對(duì)于不分泌型MM細(xì)胞,上述機(jī)制不發(fā)揮作用,對(duì)于BZ的敏感性較差。 二、分子伴侶(Chaperon)作為細(xì)胞保護(hù)性的UPR蛋白,在UPR激活時(shí)轉(zhuǎn)錄、翻譯水平增加,幫助未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白正確地折疊與組裝。BZ通過阻斷UPR中的ERAD提高M(jìn)M細(xì)胞內(nèi)ER壓力,激活了UPR,但BZ增加MM細(xì)胞內(nèi)ER壓力的同時(shí)分子伴侶的表達(dá)量?jī)H略微上升,與基礎(chǔ)表達(dá)水平并無顯

15、著差異。漿細(xì)胞作為專業(yè)性分泌細(xì)胞,ER固有的伴侶分子的組成性高表達(dá)是其特征,是其發(fā)揮正確地組裝、分泌免疫球蛋白這些生理功能所必需的。漿細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞保護(hù)性的UPR蛋白--伴侶分子的表達(dá)量可能已經(jīng)接近最大化,因此任何額外的ERS并不能使其進(jìn)一步顯著增加。 三、XBP-1是UPR的關(guān)鍵靶基因,PI不但可以從源頭上阻止具有轉(zhuǎn)錄活性的XBP-1s的產(chǎn)生,而且可以通過穩(wěn)定XBP-1u蛋白來負(fù)性調(diào)節(jié)XBP-1s的功能。XBP-1激活后其下游靶基

16、因如伴侶分子等對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用,PI通過抑制XBP-1激活阻止UPR對(duì)腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用。 四、PI-方面通過抑制ERAD增加了惡性漿細(xì)胞內(nèi)的ERS,激活了UPR；另-方面通過抑制XBP-1的激活阻止UPR中對(duì)細(xì)胞生存有利的下游靶基因的激活,解除了UPR對(duì)細(xì)胞保護(hù)的一面,使細(xì)胞內(nèi)UPR程度升高激活凋亡通路。這可能是除了抑制NF-κB以外PI發(fā)揮抗骨髓瘤活性的另一個(gè)重要機(jī)制。 五、低劑量2ME2誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生分化的同