熱休克蛋白作為多發(fā)性骨髓瘤免疫治療靶向的研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤是血液系統(tǒng)第二常見的惡性腫瘤，在美國2010年全年新發(fā)病人數(shù)大概在20000人。骨髓瘤占所有血液系統(tǒng)惡性腫瘤13.4％，占所有因血液系統(tǒng)惡性腫瘤死亡的19％及所有腫瘤死亡的2％。美國2010年有10,000名左右患者因骨髓瘤死亡。骨髓瘤患者的總體預(yù)后是不好的。接受常規(guī)治療的患者中位生存為3-4年，而接受自體外周血造血干細胞移植患者中位生存被延長到5-7年，一些新藥也已經(jīng)與其他傳統(tǒng)療法聯(lián)合應(yīng)用于臨床并可能進一步改善預(yù)后。但就目

2、前結(jié)果提示，幾乎所有患者最終都會復(fù)發(fā)。異基因造血干細胞移植是目前唯一一種能有希望治愈多發(fā)性骨髓瘤的治療手段，但是選擇異基因造血干細胞移植治療的時機及這種治療起到的作用尚存在爭論。多發(fā)性骨髓瘤患者化療/移植后復(fù)發(fā)的根源是機體內(nèi)殘存的微小殘留病灶，我們迫切的需要一種治療方式，它能夠在患者完成造血干細胞移植后清除微小殘留病灶。免疫治療可以成為控制或消除微小殘留病灶的一個選擇，我們期待它能夠鞏固接受化療或干細胞移植治療患者的療效。
　　

3、 骨髓瘤細胞分泌的單克隆免疫球蛋白都帶有獨特的抗原決定簇，這可能成為一個腫瘤特異性抗原。有學(xué)者將患者血漿中的獨特型免疫球蛋白提取并接種在患者體內(nèi)進行免疫治療，但是結(jié)果不盡如人意。部分原因是因為這種獨特型免疫球蛋白免疫原性較弱，而且每位患者體內(nèi)的這種獨特型抗原都是獨一無二的，其他患者無法從針對該獨特型免疫球蛋白的疫苗或其介導(dǎo)的細胞毒性T細胞(CTL)抗骨髓瘤效應(yīng)中受益。因此我們迫切的需要一種新的腫瘤相關(guān)抗原作為骨髓瘤免疫治療靶點，這個靶點

4、應(yīng)當(dāng)是大部分骨髓瘤細胞共有的一種抗原，并且可以在大部分患者中誘導(dǎo)出足夠強的免疫反應(yīng)。
　　 熱休克蛋白就是具有這些特點的一類腫瘤相關(guān)抗原，它包括熱休克蛋白27、熱休克蛋白70及熱休克蛋白90,在很多腫瘤中優(yōu)先的高表達，并且在某些腫瘤中的高表達常提示患者預(yù)后極差并對治療藥物耐受。同時熱休克蛋白對于腫瘤細胞的生存至關(guān)重要，下調(diào)或者抑制熱休克蛋白的表達會使骨髓瘤細胞顯著凋亡。一種熱休克蛋白90的抑制劑已經(jīng)完成了Ⅰ期臨床試驗。
　

5、　 熱休克蛋白的這些特性使它成為合適的新型候選腫瘤相關(guān)抗原。熱休克蛋白在多發(fā)性骨髓瘤中高表達，而在正常組織中表達水平很低，并且它在骨髓瘤細胞的生存中起到不可替代的作用。有研究證明腫瘤細胞中熱休克蛋白90復(fù)合物是活化并且具有高親和力，而在正常組織中則處于失活狀態(tài)，這也使得熱休克蛋白成為腫瘤治療的優(yōu)良靶點。
　　 我們假設(shè)在骨髓瘤細胞中廣泛高表達的熱休克蛋白是骨髓瘤細胞的抗凋亡分子，并將其作為骨髓瘤免疫治療的新靶點。本實驗共分為三

6、個部分：第一部分，篩選熱休克蛋白來源HLA-A0201限制性CTL表位肽；第二部分，體外驗證細胞毒性T細胞對骨髓瘤細胞的細胞毒作用；第三部分，建立原代多發(fā)性骨髓瘤SCID-rab動物模型并驗證熱休克蛋白特異性細胞毒性T細胞在動物體內(nèi)的抗骨髓瘤作用。
　　 第一部分篩選熱休克蛋白來源HLA-A0201限制性CTL表位肽并驗證其免疫原性
　　 目的：篩選熱休克蛋白來源HLA-A0201限制性表位肽并驗證其免疫原性。
　

7、　 方法：用肽積分系統(tǒng)(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)對熱休克蛋白27、熱休克蛋白70及熱休克蛋白90α來源的HLA-A0201限制性CTL表位肽進行預(yù)測，用(http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com)系統(tǒng)對預(yù)測結(jié)果確認。合成出積分最高的四條肽段，用HLA-A0201+T2雜交瘤細胞驗證肽段的親和力及穩(wěn)定性，進一步篩選出親和力及穩(wěn)定性最佳的兩條肽段用

8、來誘導(dǎo)肽段特異性細胞毒性T細胞產(chǎn)生。合成HLA-A0201-肽段四聚體用以檢測Hsp-CTLs細胞陽性率。最后，我們給HLA-A0201轉(zhuǎn)基因小鼠接種所篩選的熱休克蛋白肽段，兩周后處死小鼠取脾臟細胞，檢測是否有熱休克蛋白特異性細胞毒性T細胞產(chǎn)生并驗證這些細胞毒性T細胞的功能。
　　 結(jié)果：通過積分系統(tǒng)我們預(yù)測并挑選出積分最高的4條肽段，分別是熱休克蛋白27相關(guān)肽段aa27，序列為RLFDQAFGL；熱休克蛋白70相關(guān)肽段aa39

9、3，序列為LLLLDVAPL；熱休克蛋白90相關(guān)肽段aa362，序列為KLYVRRVFI；熱休克蛋白90α相關(guān)肽段aa670,序列為ALLSSGFSL。通過進一步T2細胞結(jié)合試驗，我們篩選出結(jié)合力和穩(wěn)定性最強的兩條肽段aa27及aa670。我們通過四聚體檢測健康供者及患者體內(nèi)aa27及aa670特異性細胞毒性T細胞水平，發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)aa27及aa670四聚體陽性細胞毒性T細胞水平較健康供者上升，證明篩選合成的肽序列為生理狀態(tài)下產(chǎn)生的表位

10、肽片段。
　　 結(jié)論：所篩選的熱休克蛋白肽段aa27及aa670與HLA-A0201分子親和力最高，結(jié)合后穩(wěn)定性最強，并且在患者體內(nèi)可以檢測到以上肽段特異性細胞毒性T細胞。將篩選的熱休克蛋白90肽段接種到HLAA0201+轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)后我們檢測到了熱休克蛋白特異性細胞毒性T細胞，這提示我們篩選的肽段具有免疫原性。
　　 第二部分體外驗證細胞毒性T細胞對骨髓瘤細胞的細胞毒作用并研究其特性
　　 目的：通過體外實驗

11、驗證細胞毒性T細胞對骨髓瘤細胞的細胞毒作用并了解細胞毒性T細胞特性及細胞毒作用機制。
　　 方法：用HLA-A0201+健康供者外周血誘導(dǎo)出肽段特異性細胞毒性T細胞，用HLAA0201+四聚體檢測所肽段特異性細胞毒性T細胞水平，用流式細胞學(xué)方法檢測細胞毒性T細胞表型及其分泌的細胞因子，用流式細胞學(xué)及CCK-8方法驗證細胞毒性T細胞的增殖，用乳酸脫氫酶釋放試驗及流式細胞學(xué)方法驗證細胞毒性T細胞分別對U266、ARH-77、RPMI

12、8226、LP1細胞株及骨髓瘤原代細胞、HLA-A0201+健康供者PBMC的殺傷作用，用流式細胞學(xué)方法檢測細胞毒性T細胞功能。
　　 結(jié)果：將外周血單個核細胞與肽段沖擊過的自體樹突狀細胞共培養(yǎng)四周后，在共培養(yǎng)的淋巴細胞中可以檢測到比例逐漸上升的四聚體陽性的細胞毒性T細胞，其比例由共培養(yǎng)前的不足1％上升到超過20％，這些淋巴細胞的表型也從低表達CD45RO高表達CD45RA轉(zhuǎn)換為高表達CD45RO低表達CD45RA，并且分泌IF

13、N-γ。我們將肽段沖擊過的DC與T淋巴細胞共培養(yǎng)并與未經(jīng)過肽段沖擊過的DC與T淋巴細胞共培養(yǎng)作為對照，用CCK-8測試發(fā)現(xiàn)與肽段沖擊DC共培養(yǎng)的淋巴細胞明顯增殖，而另一組沒有增殖。我們將與肽段沖擊過DC共培養(yǎng)的淋巴細胞分別與HLA-A020+骨髓瘤細胞株及HLA-A0201-骨髓瘤細胞株共培養(yǎng)并設(shè)置空白對照，發(fā)現(xiàn)與ARH-77(HLA-A0201+)細胞共培養(yǎng)的T淋巴細胞發(fā)生明顯增殖，而與LP1(HLA-A0201-)共培養(yǎng)及未與腫瘤細

14、胞共培養(yǎng)的兩組淋巴細胞無增殖現(xiàn)象。將這些淋巴細胞與不同細胞株、原代細胞或PBMC共培養(yǎng)后通過乳酸脫氫酶釋放試驗及流式細胞學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)其對HLA-A0201+細胞株U266、ARH-77及HLA-A0201+骨髓瘤原代細胞有明顯的細胞毒作用，而對HLA 0201-的細胞株RPMI8226、LP1及來自健康供者的HLA 0201+PBMC沒有細胞毒作用，同時我們發(fā)現(xiàn)在殺傷過程中CD8+的CTL細胞表達CD107α水平明顯上升，并且細胞毒作用

15、通過perforin及granzyme B途徑發(fā)揮作用。
　　 結(jié)論：熱休克蛋白肽段aa27及aa670可以誘導(dǎo)出該肽段HLA0201+細胞毒性T細胞，并且具有細胞活性，對HLA-A0201+的骨髓瘤細胞株及骨髓瘤原代細胞具有細胞毒作用，并通過Perforin及granzyme B機制起作用。
　　 第三部分驗證Hsp-CTLs在原代多發(fā)性骨髓瘤動物模型SCID-rab中的抗骨髓瘤效應(yīng)
　　 目的：建立SCID-

16、rab原代多發(fā)性骨髓瘤動物模型并驗證Hsp-CTLs在動物體內(nèi)的抗骨髓瘤作用。
　　 方法：給10只6-8周雄性CB.17-SCID小鼠植入4周齡新西蘭兔四肢扁骨，4-6周后將當(dāng)天分離好的骨髓瘤患者原代CD138+骨髓瘤細胞注射入已植入的骨腔中，每周留取小鼠血樣并檢測輕鏈水平，每周進行X線照射觀察植入兔骨變化，判斷是否成瘤及決定治療時機。成瘤后即開始按照分組情況通過鼠尾靜脈注射Hsp-CTLs細胞。腫瘤注射起開始計算生存期，至腫

17、瘤面積達到225mm2算作死亡。用脫頸方法處死腫瘤達到225mm2小鼠，取瘤組織行病理學(xué)免疫組化檢測。小鼠全部死亡后計算生存期。
　　 結(jié)果：在注射CD138+原代骨髓瘤細胞的9只SCID-rab小鼠中，4只成瘤，成瘤率44.4％。成瘤小鼠生存時間為49-70天，較未成瘤小鼠明顯縮短，其差別有統(tǒng)計學(xué)意義p<0.05。接受Hsp-CTLs細胞治療后，HLA-A0201+荷瘤小鼠生存期延長，但因例數(shù)較少，尚無統(tǒng)計學(xué)意義。