γδT細(xì)胞用于多發(fā)性骨髓瘤免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　研究γδT細(xì)胞對(duì)MM（multiple myeloma，骨髓瘤）細(xì)胞的殺傷作用和對(duì) imDCs（immature dendritic cells，未成熟樹突狀細(xì)胞）轉(zhuǎn)分化為 OCs（osteoclast cells，破骨細(xì)胞）的抑制作用。
　　方法：
　?。?）采集健康志愿者外周血，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離獲得PBMNCs（peripheralblood mononuclear cells，外周血單個(gè)核細(xì)胞），并在1

2、μM Zol（zoledronate，唑來膦酸）和200 IU/ml rhIL-2（recombinant human interleukin-2，重組人白介素-2）的條件下擴(kuò)增獲得γδT細(xì)胞，免疫磁珠法分選培養(yǎng)至第7天的γδT細(xì)胞；
　　（2）收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MM8226細(xì)胞株，與磁珠分選獲得的γδT細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)，通過LDH（lactate dehydrogenase，乳酸脫氫酶）法檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)MM8226細(xì)胞株的殺傷

3、作用；并比較分別用10μg/ml抗人γδ TCR mAb（monoclonal antibody，單克隆抗體）、抗人NKG2D mAb、抗人γδTCR mAb+抗人NKG2D mAb及抗鼠IgG mAb封閉后的γδT細(xì)胞對(duì)MM8226細(xì)胞株的殺傷作用；
　?。?）免疫磁珠法分選獲得CD14+單個(gè)核細(xì)胞，在rhIL-4（recombinant human interleukin-4，重組人白介素-4）和GM-CSF（granuloc

4、yte-macrophage colony stimulating factor，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子）的作用下分化為 imDCs，后者在M-CSF（macrophage colony stimulating factor，巨噬細(xì)胞集落刺激因子）和sRANKL（soluble nuclear factor kappa B predominate ligand receptor activation factors，可溶性細(xì)胞核因

5、子κB受體活化因子配體）共同作用下轉(zhuǎn)分化為具有骨吸收作用的OCs；
　?。?）免疫磁珠分選獲得的γδT細(xì)胞與CD14+單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)imDCs途徑轉(zhuǎn)分化為OCs的各個(gè)階段，通過直接和間接接觸的方式以不同比例共培養(yǎng)至第14天，通過TRAP（tartrate-resistant acid phosphatase，抗酒石酸酸性磷酸酶）染色觀察γδT細(xì)胞對(duì)OCs生成數(shù)量的影響；
　?。?）將抗體封閉后的γδT細(xì)胞與imDCs以10:1

6、的比例直接共培養(yǎng)至第14天，通過TRAP染色觀察生成OCs的情況；
　?。?）收集不同培養(yǎng)組上清液，通過ELISA方法檢測(cè)不同階段、不同比例上清液中IFN-γ（interferon-γ，干擾素-γ）和CTX-I（Type I collagen end Carboxy-terminal peptide，I型膠原C-末端肽）濃度變化。
　　結(jié)果：
　?。?）證實(shí)體外條件下可通過Zol和IL-2擴(kuò)增獲得γδT細(xì)胞；
　

7、?。?）γδT細(xì)胞與MM8226細(xì)胞株按效靶比為10:1、1:1、1:10混合培養(yǎng)4小時(shí)，γδT細(xì)胞對(duì)其殺傷率分別為41.69％、26.88%、9.97%，顯示γδT細(xì)胞對(duì)MM細(xì)胞具有殺傷作用，且呈劑量依賴性；分別用抗人γδTCR mAb、抗人NKG2DmAb、抗人γδTCR mAb+抗人NKG2D mAb及抗鼠IgG mAb封閉γδT細(xì)胞后，將γδT細(xì)胞與MM8226細(xì)胞株按10:1的效靶比混合培養(yǎng)時(shí)，各組殺傷率分別為21.56%、2

8、6.86%、14.93%、42.03%，顯示TCR-γδ途徑被阻斷后，γδ T細(xì)胞對(duì)MM8226細(xì)胞株的殺傷力減低，且比NKG2D途徑阻斷后的殺傷率減低更明顯；
　?。?）γδT細(xì)胞與CD14+PBMNCs直接共培養(yǎng)組中基本見不到TRAP染色陽性細(xì)胞；間接共培養(yǎng)組中，當(dāng)兩者比例為1:5時(shí)，TRAP染色陽性多核巨細(xì)胞數(shù)為8.33±2.08（- x±S）個(gè)/10個(gè)視野，遠(yuǎn)低于CD14+PBMNCs單獨(dú)培養(yǎng)組（37.67±2.05個(gè)/1

9、0個(gè)視野）（p<0.05）；γδT細(xì)胞與imDCs直接共培養(yǎng)組中，兩者比例分別為1:10、1:1、10:1時(shí)，TRAP染色陽性的多核巨細(xì)胞數(shù)目分別為14.33±2.08個(gè)/10個(gè)視野、9.67±2.52個(gè)/10個(gè)視野、3.33±1.53個(gè)/10個(gè)視野，各組之間以及與imDCs單獨(dú)培養(yǎng)組（37.67±2.05個(gè)/10個(gè)視野）之間比較，OCs均生成減少（p值均小于0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在γδT細(xì)胞與imDCs間接共培養(yǎng)組中，兩者

10、比例分別為1:10、1:1、10:1時(shí)，TRAP染色陽性的多核巨細(xì)胞數(shù)目分別為24.67±2.08個(gè)/10個(gè)視野、15.53±1.33個(gè)/10個(gè)視野、7.67±0.58個(gè)/10個(gè)視野，各組與imDCs單獨(dú)培養(yǎng)組之間差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p值均小于0.05）；γδT細(xì)胞與OCs直接或間接共培養(yǎng)組中，均可見到已經(jīng)生成的OCs被溶解、皺縮，并顯示相同比例的兩種細(xì)胞共培養(yǎng)，直接混合培養(yǎng)相對(duì)間接共培養(yǎng)，γδT細(xì)胞對(duì)各個(gè)階段的抑制作用更明顯；并且，

11、γδT細(xì)胞對(duì)imDCs轉(zhuǎn)分化為OCs過程中的抑制作用呈劑量依賴性，隨著γδT細(xì)胞比例的增高，其抑制作用相對(duì)更明顯；
　　（4）抗人γδTCR mAb、抗人NKG2D mAb、抗人γδTCR mAb+抗人NKG2D mAb及抗鼠IgG mAb封閉后的γδT細(xì)胞與imDCs以10:1直接共培養(yǎng)時(shí)，TRAP染色陽性的多核巨細(xì)胞數(shù)目（2.33±0.47個(gè)/10個(gè)視野）并未比相同比例的無抗體封閉培養(yǎng)組（3.33±1.53個(gè)/10個(gè)視野）數(shù)目

12、增加，顯示抗體封閉并未對(duì)γδT細(xì)胞抑制OCs生成的過程產(chǎn)生影響（p>0.05）；
　　（5）γδT細(xì)胞與imDCs共培養(yǎng)比例分別為1:1、5:1、10:1時(shí)，培養(yǎng)24小時(shí)后直接共培養(yǎng)組上清中IFN-γ的濃度分別為617.09 pg/ml、900.1 pg/ml、1277.34 pg/ml，間接共培養(yǎng)組濃度分別為509.68pg/ml、786.49 pg/ml、1045.5 pg/ml。顯示隨著γδT細(xì)胞比例的增高，其分泌IFN-γ

13、的能力亦隨之增高，且 imDCs與γδT細(xì)胞直接共培養(yǎng)相對(duì)間接共培養(yǎng)來說，imDCs刺激γδT細(xì)胞分泌IFN-γ的能力更明顯；當(dāng)兩種細(xì)胞比例為1:1時(shí)，γδT細(xì)胞與CD14+單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，CTX-I基本不分泌；與imDCs以1:1比例共培養(yǎng)時(shí)，直接接觸共培養(yǎng)上清液中CTX-I的水平（397.01 pg/ml）低于間接接觸共培養(yǎng)組（459.47 pg/ml）；γδT細(xì)胞與OCs作用24小時(shí)后，直接共培養(yǎng)組上清液中檢測(cè)不到CTX-I，

14、間接組的水平（83.245 pg/ml）低于OCs單獨(dú)培養(yǎng)組（889.54 pg/ml），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　?。?）體外培養(yǎng)條件下，γδT細(xì)胞具有殺傷MM細(xì)胞的作用，其機(jī)制可能與其表面TCR和NKG2D受體介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān)；
　?。?）γδT細(xì)胞可在OCs分化發(fā)育的各個(gè)階段抑制OCs的生成并溶解成熟OCs，其抑制作用的機(jī)制并不與細(xì)胞表面TCR和NKG2D受體介導(dǎo)的途徑有關(guān)；