未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)在缺氧心肌細(xì)胞中的相關(guān)探索.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過建立缺氧心肌模型并測定未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)GRP78及XBP-1s mRNA相對(duì)含量的變化；進(jìn)而評(píng)估未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）在心肌細(xì)胞不同缺氧時(shí)段的變化，最后揭示未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）在缺氧心肌細(xì)胞中的可能機(jī)理,可對(duì)如何減輕心肌缺氧損傷，及改善缺氧性心臟病的治療現(xiàn)狀提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)主要分為三步：第一：從乳鼠心肌組織中提取心肌細(xì)胞并做心肌細(xì)胞鑒定；第二：將提取的心肌細(xì)胞移置三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培

2、養(yǎng)箱中氧濃度為1％、二氧化碳濃度為5%，建立缺氧模型；第三：按要求培養(yǎng)細(xì)胞后收集細(xì)胞并提取目的基因RAN進(jìn)行擴(kuò)增；本實(shí)驗(yàn)分為6組，分別記為H0、H6、H12、H24、H48、H72，實(shí)驗(yàn)中將在正常氧濃度中培養(yǎng)24小時(shí)的心肌細(xì)胞取出，吸出培養(yǎng)基并用PBS液沖洗，吸凈后加入少量培養(yǎng)基，濾菌器過濾CO2及N2混合氣體，并以2L/min流量向培養(yǎng)瓶中通入，5min后移至三氣培養(yǎng)箱中，設(shè)定條件為1% O2、5% CO2，建立缺氧模型，分別培養(yǎng)0小

3、時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后收獲心肌細(xì)胞；提取各組心肌細(xì)胞的總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR)檢測目的基因GRP78/Bip和 XBP-1s mRNA表達(dá)水平的變化，最后通過對(duì)組間相關(guān)數(shù)據(jù)的分析，評(píng)估未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）在缺氧不同時(shí)段的變化。
　　結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參基因，目的基因GRP78/Bip和 XBP-1s的光密度與GAPDH的光密度的比值記作目的基因的相對(duì)含量；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

4、應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)：GRP78/Bip mRNA H0與H6、H6與H24、H24與H72組之間均有顯著性差異（p<0.05），表明隨著缺氧時(shí)間的增加GRP78/Bip mRNA表達(dá)逐漸增高，直至72小時(shí)達(dá)到高峰；XBP-1s mRNA缺氧H6、H12、H24、H48組之間均有顯著性差異（p<0.05），從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見 XBP-1s mRNA在缺氧6小時(shí)內(nèi)便有明顯的表達(dá)，12小時(shí)過后表達(dá)量逐漸下降，直至72小

5、時(shí)左右降至正常水平；
　　結(jié)論：1.XBP-1s可能是缺氧早期促進(jìn)心肌細(xì)胞存活的重要激酶之一，但是其在心肌慢性缺氧適應(yīng)中的作用較弱，這可能與GRP78/Bip的過表達(dá)抑制有關(guān)；
　　2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GRP78/Bip mRNA的表達(dá)隨著缺氧時(shí)間的增加逐漸增高，這可能與血小板反應(yīng)素4的參與有關(guān)，與XBP-1s相比GRP78/Bip在持續(xù)性應(yīng)激或劇烈應(yīng)激中可能更有意義。
　　3. IRE通路在未折疊蛋白反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡中可