阻斷離子通道影響人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡及RNA編輯酶ADAR 1表達的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、喉癌發(fā)生發(fā)展機制復(fù)雜，至今未完全明了。細(xì)胞惡性變與細(xì)胞信號傳導(dǎo)的過程緊密相關(guān)，信號傳導(dǎo)的異常在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，而細(xì)胞信號傳導(dǎo)與多種因素如蛋白質(zhì)代謝、離子通道功能狀態(tài)等密切相關(guān)。
　　 首先，細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中伴隨著大量的蛋白質(zhì)代謝，而蛋白質(zhì)代謝與RNA編輯密切相關(guān)。RNA編輯是轉(zhuǎn)錄后mRNA和tRNA堿基變化的現(xiàn)象，是一種對基因編碼的mRNA進行重新修飾的過程，RNA編輯改變可使得RNA所攜帶的遺傳信息發(fā)

2、生改變，導(dǎo)致最終的蛋白序列、結(jié)構(gòu)和功能的變化。對RNA發(fā)生編輯作用的酶稱為RNA編輯酶，在從原蟲到哺乳動物的體內(nèi)廣泛存在，近來越來越多的研究表明RNA編輯酶的異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　 其次，細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中伴隨著細(xì)胞膜離子通道功能狀態(tài)的改變。
　　 鉀離子通道廣泛分布在生物細(xì)胞中，其中延遲整流鉀通道屬于電壓門控鉀離子通道，除在可興奮細(xì)胞起決定動作電位的復(fù)極相及維持不應(yīng)期的作用外，還與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖有關(guān)。氯

3、離子是生物體內(nèi)最多的陰離子，在維持靜息膜電位，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣、pH值、細(xì)胞增生和分化中起著重要的作用，研究表明氯離子通道和細(xì)胞增殖及凋亡密切相關(guān)。鈣離子通道是一種極為常見的信號傳遞通路，鈣離子通道的變化可影響腫瘤細(xì)胞的生長，其阻滯劑能通過抑制鈣離子的內(nèi)流與釋放影響腫瘤細(xì)胞的生長增殖。
　　 為探討喉癌發(fā)生發(fā)展與離子通道、RNA編輯酶ADAR1表達的關(guān)系，本研究在體外培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞的基礎(chǔ)上，采用穿孔膜片鉗全細(xì)胞記錄法、MTT比色

4、法、結(jié)晶紫比色法、流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL染色法、 Western blot及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）等方法觀察Hep-2細(xì)胞離子通道特性、喉癌組織RNA編輯酶ADAR1的表達、阻斷離子通道對Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡、ERK1/2、AKT1蛋白磷酸化水平及RNA編輯酶ADAR1表達的影響及其相關(guān)性。
　　 為進一步明確離子通道阻斷劑在體內(nèi)代謝后對腫瘤的影響，本研究以Hep-2細(xì)胞株建立移植瘤模型，應(yīng)用不同濃度的氯離子通

5、道阻斷劑（NPPB）分組進行治療實驗，觀察NPPB的抑瘤作用，并探討其可能機制。本研究分為以下三部分：
　　 第一部分 Hep-2細(xì)胞離子通道特性及喉癌組織RNA編輯酶ADAR1的表達。
　　 第二部分阻斷離子通道對人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡、ERK1/2、AKT1蛋白磷酸化及RNA編輯酶ADAR1表達的影響。
　　 第三部分氯離子通道阻滯劑NPPB對人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用。
　　 本文采用穿孔

6、膜片鉗全細(xì)胞記錄法、MTT比色法、結(jié)晶紫比色法、流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL染色法、Western blot及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)等方法觀察了Hep-2細(xì)胞離子通道特性、喉癌組織RNA編輯酶 ADAR1 mRNA的表達、阻斷離子通道對Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡、ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平及RNA編輯酶ADAR1 mRNA的影響，并探討了體內(nèi)阻斷氯通道對人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其可能機制，得出如下結(jié)論：
　　 1.Hep-2

7、細(xì)胞具有電壓依賴、外向整流特性的鉀離子通道及容積敏感性、外向整流特性及電壓依賴性的氯離子通道，具有低電壓激活的鈣離子通道，即T-型鈣通道；
　　 2.Hep-2細(xì)胞、喉癌及其喉旁組織ADAR1 mRNA均有表達，RNA編輯酶ADAR1與喉癌的發(fā)生有關(guān)，但與臨床分期、病理分級及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)；
　　 3.阻斷鉀、氯、鈣通道可抑制Hep-2細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，阻斷離子通道抑制Hep-2細(xì)胞增殖和

8、誘導(dǎo)凋亡可能是通過改變細(xì)胞周期而實現(xiàn)的，呈時間劑量依賴關(guān)系；
　　 4.阻斷鉀、氯、鈣通道可濃度依賴性地下調(diào)Hep-2細(xì)胞ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平的表達， ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平的降低與離子通道阻斷劑抑制Hep-2細(xì)胞增殖密切相關(guān)；
　　 5.阻斷鉀、氯、鈣通道濃度依賴性下調(diào)Hep-2細(xì)胞RNA編輯酶ADAR1mRNA的相對表達，RNA編輯酶ADAR1mRNA相對表達量與離子通道阻斷劑抑制Hep

9、-2細(xì)胞增殖密切相關(guān)；
　　 6.成功構(gòu)建了人喉癌Hep-2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，證實NPPB（50、100和150μM）能抑制喉癌移植瘤生長，對機體無明顯毒副作用；
　　 7.與體外實驗結(jié)果相似，阻斷氯通道下調(diào)喉癌裸鼠移植瘤ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平的表達；同時下調(diào)RNA編輯酶ADAR1 mRNA表達；體內(nèi)證實了阻斷氯通道對人喉癌裸鼠移植瘤的生長抑制作用，其機制可能與下調(diào)ERK1/2和 AKT1蛋白磷酸化水