低氧對人喉癌Hep-2細(xì)胞c-met蛋白表達(dá)及細(xì)胞殖的影響.pdf

1、目的：肝細(xì)胞生長因子受體（hepatocyte growth factor receptor，c-met）對細(xì)胞增殖、分化、形態(tài)發(fā)生和浸潤運動等均有調(diào)節(jié)作用，與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本實驗通過模擬人體實體腫瘤低氧環(huán)境，檢測人喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞的增殖、凋亡以及c-met、HIF-1α（hypoxia-inducible factorl，HIF-1）蛋白表達(dá)，旨在探討低氧對喉癌Hep-2細(xì)胞c-met蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖的

2、影響，從而為腫瘤的發(fā)生機(jī)制及抗腫瘤靶向治療提供理論依據(jù)與實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境處理：低氧培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2、2％O2、93％N2、飽和濕度，對照常氧培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5％CO2、20％O2、75％N2、飽和濕度。
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定人喉癌Hep-2細(xì)胞表面c-met蛋白的表達(dá)。
　　 3.流式細(xì)胞檢測喉鱗狀細(xì)胞系Hep-2低氧以及常氧6h、12h、24h、36h

3、 c-met、HIF-1α蛋白的表達(dá)情況及細(xì)胞凋亡率的變化。
　　 4.應(yīng)用MTT法檢測低氧組與常氧組6h、12h、24h、36h細(xì)胞增殖率的不同，加入40ng/ml HGF組與不加HGF組6h、12h、24h、36h細(xì)胞增殖率的不同。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測，與陰性對照組相比，實驗組細(xì)胞膜上可見黃褐色顆粒，為c-met蛋白顯色，證明人喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞表面有c-met蛋白表達(dá)。

4、
　　 2.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測常氧6h、12h、24h、36h c-met蛋白FI分別為：1.062±0.087、1.057±0.034、1.082±0.018、1.111±0.056；低氧6h、12h、24h、36h c-met蛋白FI分別為：1.079±0.042、1.088±0.036、1.167±0.058、1.109±0.029；常氧6h、12h、24h、36h HIF-1α蛋白FI分別為：1.002±0.027、1.

5、119±0.021、1.140±0.030、1.161±0.065；低氧6h、12h、24h、36h HIF-1α蛋白F1分別為：1.163±0.072、1.214±0.011、1.268±0.011、1.149±0.085。HIF-1α與c-met蛋白表達(dá)均在低氧6h、12h、24h逐漸升高，24h為高峰，24h至36h逐漸下降；兩個蛋白在常氧環(huán)境下表達(dá)穩(wěn)定，無時間依賴性；HIF-1α于低氧6h、12h、24h、36h蛋白表達(dá)均比常氧

6、明顯增強(qiáng)，c-met于12h、24h蛋白表達(dá)比常氧增強(qiáng)。說明低氧可促進(jìn)HIF-lα與c-met蛋白表達(dá)。HIF-1α與c-met蛋白在低氧6h、12h、24h呈正相關(guān)（r=0.710，p<0.05），且HIF-1α的表達(dá)優(yōu)先于c-met，說明c-met受HIF-1α的調(diào)節(jié)。
　　 3.常氧與低氧細(xì)胞增殖率均呈逐漸升高趨勢，無HGF的常氧組與低氧組6h、12h、24h、36h各時間點下比較于24h有顯著差別（p<0.01），6h、

7、12h、36h無差異；常氧條件下各時間點組之間兩兩比較均有顯著差異（p<0.01），低氧條件下各時間點組之間兩兩比較也均有顯著差異（p<0.01）。細(xì)胞增殖率與HIF-1α蛋白于低氧6h、12h、24h呈明顯正相關(guān)（r=0.811，p<0.01）。表明低氧可促進(jìn)細(xì)胞增殖，且細(xì)胞增殖率可隨時間延長逐漸增高。
　　 4.常氧HGF（40ug/L）組及低氧HGF（40ug/L）組細(xì)胞增殖率均隨時間延長逐漸升高。常氧條件下，無HGF組與

8、HGF40ug/L組于12h有差異（p<0.05），24h有顯著差異（p<0.01）；低氧條件下，無HGF組與HGF40ug/L組于24h有顯著差異（p<0.05）。細(xì)胞增殖率與HIF-1α蛋白于低氧6h、12h、24h呈正相關(guān)（r=0.682，p<0.05）。說明HGF/c-met可促進(jìn)細(xì)胞增殖，且細(xì)胞增殖率可隨時間延長逐漸增高。
　　 5.常氧條件下，6h、12h、24h、36h各時間點之間細(xì)胞凋亡率無明顯差別（p>0.05

9、）；低氧條件下，6h、12h、24h之間兩兩比較無明顯差別，36h與6h、12h、24h之間有差別，于36h凋亡率有升高趨勢；常氧6h、12h、24h凋亡率與低氧6h、12h、24h相比統(tǒng)計學(xué)差異顯著（p<0.01），低氧細(xì)胞凋亡率于6h、12h、24h較常氧狀態(tài)下低，常氧36h凋亡率與低氧36h相比有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05），低氧細(xì)胞凋亡率于36h較常氧狀態(tài)下高。表明低氧能夠抑制細(xì)胞凋亡，但在一定的條件下還可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

10、　　 結(jié)論：
　　 1.人喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞表面確實有c-met蛋白的大量表達(dá)。
　　 2.體外實驗控制細(xì)胞低氧生存環(huán)境，低氧可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞HIF-1α及c-met蛋白的表達(dá)，常氧環(huán)境下兩種蛋白表達(dá)相對穩(wěn)定，并且低氧可能通過提高HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)而調(diào)節(jié)c-met基因的表達(dá)，c-met蛋白表達(dá)水平隨HIF-1α升高而升高，二者呈正相關(guān)，但HIF-1α的表達(dá)優(yōu)先于c-met，隨著時間的延長，后期細(xì)胞長

11、期持續(xù)缺氧出現(xiàn)兩種蛋白表達(dá)的下降。
　　 3.1氐氧條件下細(xì)胞的增殖率較常氧明顯升高，HIF-1α于低氧下表達(dá)活躍，且低氧下細(xì)胞增殖率隨HIF-1α蛋白表達(dá)的增加而升高，說明低氧能夠促進(jìn)人喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2增殖，且在此促進(jìn)過程中HIF-1α起到了重要作用。
　　 4.通過外來給予HGF干預(yù)，刺激Hep-2細(xì)胞表達(dá)c-met蛋白增加，發(fā)現(xiàn)無論在常氧環(huán)境還是低氧環(huán)境下加入HGF的細(xì)胞增殖率都有升高，說明HGF/c-met