氯離子通道阻斷劑對Tunicamycin誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、凋亡(apoptosis)，也可以稱為細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)。誘導(dǎo)凋亡的途徑包括死亡受體和線粒體途徑；而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡逐漸被認(rèn)識，其在多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。因此抑制ERS，減輕凋亡可能是治療心血管疾病的新策略。
　　凋亡的早期階段伴隨著細(xì)胞持續(xù)性的皺縮，即凋亡性容積減小（apopto

2、tic volume decrease，AVD）。大量的研究表明，Cl-外流以及伴隨的水外流導(dǎo)致的AVD是細(xì)胞凋亡的重要前提，并且早于caspases的激活；而阻斷氯離子通道減輕了AVD，并且可以抑制細(xì)胞凋亡。
　　本實(shí)驗(yàn)擬在衣霉素通過ERS途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的模型上，觀察氯通道阻斷劑DIDS對心肌細(xì)胞凋亡的影響，并初步探討其機(jī)制。
　　研究目的：
　　1．原代培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，應(yīng)用經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡誘導(dǎo)劑

3、Tunicamycin（Tm）構(gòu)建心肌細(xì)胞凋亡模型。
　　2．Tm誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過程中，觀察氯離子通道阻斷劑DIDS對心肌細(xì)胞存活及凋亡的影響。
　　3．初步探討氯離子通道阻斷劑DIDS對Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1．實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組，陽性對照組（Tm組）及實(shí)驗(yàn)組（Tm+DIDS），以及單獨(dú)應(yīng)用DIDS組。
　　2．四唑鹽（MTT）比色法觀察心肌細(xì)胞的存活率；流式細(xì)胞術(shù)(A

4、nexinv/PI)反映心肌細(xì)胞凋亡程度。
　　3．免疫印跡方法測定Tm誘導(dǎo)心肌凋亡過程中靶分子GRP78、CHOP蛋白水平的變化。
　　4．氯離子通道阻斷劑DIDS干預(yù)對Tm處理的心肌細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率及伴侶分子GRP78、信號分子CHOP水平的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1．與陰性對照組相比，衣霉素（Tm）組心肌細(xì)胞存活率顯著下降，并呈現(xiàn)與Tm的劑量與作用時(shí)間正相關(guān)（P<0.05，n=12）；Tm的最佳誘

5、導(dǎo)濃度為100ng/ml，作用時(shí)間為72h。
　　2．通過MTT比色法和流式細(xì)胞術(shù)來判斷心肌細(xì)胞死亡的性質(zhì)。當(dāng)Tm濃度為100ng/ml，作用72h時(shí)，心肌細(xì)胞存活率和凋亡率分別為57.4±3.2％（n=12），25.9±5.8％（n=6）。提示Tm導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的主要方式是凋亡性死亡。
　　3．Tm作用于心肌細(xì)胞后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78和CHOP表達(dá)于6h開始增加，24h達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢。
　　4．與T

6、m組相比，Tm加DIDS組的細(xì)胞存活率較Tm組顯著增加，二者分別是57.4±3.2％和80.4％±4.2％（P＜0.05，n=12）。
　　5．與Tm組相比，Tm加DIDS組的細(xì)胞凋亡率較Tm組顯著降低，二者分別是25.9±5.8％和14.3％±2.9％（P＜0.05，n=6）。
　　6．Tm處理心肌細(xì)胞24h后，細(xì)胞內(nèi)的GRP78、CHOP水平分別為陰性對照組的3倍和6.5倍，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，n=6）。而

7、Tm加DIDS共同處理心肌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的GRP78、CHOP表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，n=6）。
　　結(jié)論：
　　1．成功構(gòu)建Tm誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡模型，Tm的最佳誘導(dǎo)濃度為100ng/ml，作用時(shí)間為72h。
　　2．氯離子通道阻斷劑DIDS能夠顯著抑制Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，具有明顯的減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性心肌細(xì)胞的損傷。
　　3．氯離子通道阻斷劑DIDS明顯抑制Tm誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制