MiR-1-133對病毒性心肌炎心肌細胞離子通道表達及心功能的影響.pdf

1、MiRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，大約由20～23個核苷酸組成。在動植物和人類體內(nèi)，在轉錄后水平負性調控基因的表達，參與機體一系列的生理病理過程。研究表明，在人類基因組中，1/3的基因受miRNAs的調節(jié)。miRNAs在體內(nèi)穩(wěn)定存在，不易被降解。miRNA具有組織特異性和空間特異性，這決定了不同的miRNAs在機體不同發(fā)育階段具有不同的作用。一種miRNA有多個作用靶點mRNAs，一個mRNA的表達受多種miRNAs的調節(jié)和

2、控制。隨著分子生物學的不斷發(fā)展和人類對疾病的不斷認識，miRNAs參與的研究范圍越來越廣泛，將來可作為某些疾病的治療靶點。miR-1、miR-133為肌肉特異性miRNAs，具有心肌特異性且在心肌中豐富表達，兩者為相似的轉錄單位，通過調控靶基因參與心臟發(fā)育、心律失常、細胞凋亡、心肌肥厚等許多心血管系統(tǒng)的生理及病理過程。
　　病毒性心肌炎是兒科常見病，其心電圖常表現(xiàn)為類型不同的心律失常。急性重癥心肌炎可引起致死性心律失常、心力衰竭，

3、從而導致患兒死亡。病毒侵入心肌可引起細胞凋亡，導致心功能的衰竭。實驗表明miR-1和miR-133與細胞凋亡有關，且促凋亡相關基因caspase-9是miR-133的作用靶點，但miR-1/133對心肌炎心肌細胞凋亡的影響尚未見報道。電重構與心肌結構重構是心律失常發(fā)生的主要機制。鉀離子和鈣離子通道是心肌細胞膜主要的離子通道。研究已經(jīng)表明在病毒性心肌炎小鼠模型的心肌中miRNAs表達譜存在異常，且異常表達的miRNAs通過作用于不同的靶點

4、及傳導途徑參與不同的病理過程。同時，研究發(fā)現(xiàn)miR-1能夠穩(wěn)定靜息膜電位鉀電流Kir2.1、控制鉀電流Kv4.2mRNA的表達;miR-133可靶向性調節(jié)L型鈣通道亞單位Cav1.2的表達，這提示miR-1、miR-133對心肌細胞電活動可能具有重要的調節(jié)功能。
　　RNA干擾是目前治療心肌炎的研究熱點，RNA干擾面臨兩大難題:一是如何解決病毒通過基因變異逃避藥物的抑制作用，二是如何靶向性的將miRs導入被病毒感染的心肌細胞發(fā)揮抗

5、病毒作用。對此研究者發(fā)現(xiàn)人工合成的miRs類似物有很好的對抗病毒基因變異能力，且安全性更高;同時發(fā)現(xiàn)聯(lián)合兩種miRs干擾可明顯減少病毒逃逸。研究發(fā)現(xiàn)將熒光標記的miR-1與miR-133充分混勻，包被于RNA-LANCErⅡ轉染試劑中可以增強其靶向性，通過小鼠尾靜脈注射可成功到達心肌組織。
　　目的：
　　1、探討miR-1、miR-133是否能夠減少急性病毒性心肌炎小鼠心肌細胞的凋亡并改善心功能EF、FS。
　　2、

6、探討miR-1、miR-133是否調控急性病毒性心肌炎小鼠心肌細胞鉀離子、鈣離子通道基因和蛋白的表達，從而減少心律失常的發(fā)生。
　　方法
　　1、采用腹腔注射柯薩奇病毒CVB3 Nancy株建立急性病毒性心肌炎Balb/c小鼠模型，將小鼠隨機分為對照組、心肌炎組、心肌炎+ miR-1/133mimics組、心肌炎+ miR-1/133NC組，每組10只。建模后第2天分別給小鼠尾靜脈注射miR-1/133復合類似物(miR-1

7、/133mimics)和miR-1/133陰性對照(miR-1/133NC)。觀察各組小鼠的一般情況。
　　2、超聲心動圖測定各組小鼠的左室射血分數(shù)(EF)和左室短軸縮短率(FS)。3、采用HE染色法觀察各組小鼠的心肌形態(tài)學改變。
　　4、采用TUNEL法觀察各組小鼠的心肌細胞凋亡情況。
　　5、采用實時熒光定量qRT-PCR法檢測各組小鼠心肌組織miR-1、miR-133的相對表達量;檢測心肌細胞凋亡相關基因Bax、

8、Bcl-2、Caspase-9的相對表達量;檢測心肌組織瞬時外向鉀電流Ito通道基因Kcnd2、其轉錄抑制基因Irx5及內(nèi)向整流鉀電流Ik1通道基因Kcnj2的相對表達量;檢測心肌L型鈣離子通道亞單位基因α1c的相對表達量;
　　6、采用western blot法檢測各組小鼠心肌組織中鉀通道基因Kcnd2的靶蛋白 Kv4.2和基因Kcnj2的靶蛋白Kir2.1的相對表達量;檢測心肌L型鈣離子通道亞單位基因α1c的靶蛋白Cav1.2

9、的相對表達量。
　　結果
　　1、小鼠于腹腔注射柯薩奇病毒CVB3 Nancy株104TCID500.1mL后第2天，出現(xiàn)蜷縮，毛發(fā)無光澤、凌亂，易激惹，或者對刺激不敏感，活動減少，體重減輕。給予miR-1/133NC的小鼠的癥狀未見明顯改變。給予miR-1/133mimics的小鼠毛發(fā)較前整齊、有光澤，活動增加，體重增加。心肌炎組與心肌炎+miR-1/133 NC組小鼠的心臟較對照組小鼠的心臟大，表面有壞死灶。對照組小鼠一

10、般情況未見明顯變化。
　　2、超聲心動圖結果顯示:與對照組相比，心肌炎組和心肌炎+miR-1/133 NC組小鼠的心功能EF、FS下降(P＜0.01);miR-1/133mimics能改善心肌炎小鼠的心功能EF、FS(P＜0.01)。
　　3、HE染色顯示:對照組小鼠心肌細胞排列整齊，細胞無水腫，間質無炎性細胞浸潤;心肌炎組與心肌炎+miR-1/133NC組心肌細胞水腫、排列紊亂，炎性細胞浸潤間質;心肌炎+miR-1/133

11、mimics組心肌細胞排列較整齊，無細胞水腫，間質少量炎性細胞浸潤。
　　4、TUNEL染色結果示:對照組與心肌炎+miR-1/133mimics組凋亡的心肌細胞少，心肌炎組與心肌炎+miR-1/133NC組心肌細胞凋亡明顯增多。
　　5、實時熒光定量qRT-PCR結果顯示:
　　(1)與對照組相比，心肌炎組與心肌炎+miR-1/133NC組心肌組織miR-1、miR-133表達明顯下調(P≮0.01)，miR-1/1

12、33mimics干預可上調其表達（P＜0.05）。
　　(2)與對照組相比，心肌炎組與心肌炎+miR-1/133 NC組心肌組織抑凋亡相關基因Bcl-2表達下調（P＜0.05），而促凋亡相關基因Bax、Caspase-9表達上調（P＜0.01,P＜0.05）。miR-1/133 mimic可上調Bcl-2的表達（P＜0.05），下調Caspase-9、Bax的表達(P＜0.05,P＜0.01)。
　　(3)與對照組相比，心肌

13、炎組與心肌炎+miR-1/133 NC組心肌組織鉀離子通道基因Kcnd2、Kcnj2mRNA表達下調(P＜0.01)，miR-1/133mimics干預可上調其基因表達(P＜0.05)。
　　(4)與對照組相比，心肌炎組與心肌炎+miR-1/133 NC組心肌組織鉀離子通道轉錄抑制基因Irx5mRNA表達上調(P＜0.01)，miR-1/133mimics干預可下調其表達（P＜0.05）。
　　(5)與對照組相比，心肌炎組與

14、心肌炎+miR-1/133NC組小鼠心肌組織L型鈣離子通道基因α1cmRNA表達上調(P＜0.01)，miR-1/133mimics可下調其表達(P＜0.05)。
　　6、Western blot結果顯示:
　　(1)與對照組相比，心肌炎組與心肌炎+miR-1/133NC組心肌組織鉀離子通道蛋白Kv4.2、Kir2.1的表達量明顯下調(P＜0.01)，miR-1/133mimics可上調其表達（P＜0.05）。
　　(