建立A型流感病毒M2離子通道阻斷劑的新型篩選方法.pdf

1、流感病毒在全球范圍內(nèi)的廣泛流行，嚴重威脅人類健康和社會經(jīng)濟。禽流感病毒H5N1在亞洲流行，并出現(xiàn)感染人的H5N1病毒株，預(yù)示有可能出現(xiàn)流感大流行病毒株。M2離子通道是抗流感藥物研發(fā)的重要靶標(biāo)，建立M2離子通道模型、建立快速而穩(wěn)定的篩選方法是從化合物庫篩選獲得新型M2離子通道阻斷劑藥物的基礎(chǔ)。在本研究中，首先建立了A型流感病毒H5N1的M2離子通道蛋白的穩(wěn)定細胞：以A型流感病毒H5N1的M2基因片段(GenBank：AAV32638.1)

2、為模板，經(jīng)密碼子優(yōu)化后適合在哺乳動物細胞中高表達，人工合成野生型M2基因，命名為H5M2，并通過點突變構(gòu)建金剛烷胺耐藥突變型H5M2(S31N-L26I)。H5M2和H5M2(S31N-L26I)的DNA通過BamHⅠ和XbaⅠ酶切克隆于pcDNA4/TO質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染T-REx 293細胞經(jīng)zeocin篩選建立穩(wěn)定細胞株。穩(wěn)定株細胞用1 μg/ml四環(huán)素誘導(dǎo)后，用Western Blot和免疫熒光證實，在T-Rex293細胞中表達的M2

3、離子通道蛋白以單體、二聚體、四聚體形式存在，并主要表達在細胞膜上。H5M2和H5M2(S31N-L26I)的穩(wěn)定株細胞的膜片鉗電生理研究表明，在T-REx293細胞中表達的M2離子通道蛋白具有H+離子通道活性，金剛烷胺特異地阻斷H5M2活性，IC50值為4.18μmol/L。成功建立H5M2和H5M2(S31N-L26I)的穩(wěn)定細胞株為建立M2離子通道阻斷劑的篩選方法奠定了基礎(chǔ)。 本研究用pH敏感的綠色熒光蛋白(EGFP)來指示

4、M2離子通道的活性：以p-EGFP-C1質(zhì)粒為模板經(jīng)PCR得到EGFP的基因片段，經(jīng)BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后連接到pQCXIP載體上，在H5M2和H5M2(S31N-L26I)的穩(wěn)定細胞株中建立了pH敏感的綠色熒光蛋白(EGFP)穩(wěn)定表達細胞。在熒光顯微鏡下可見EGFP在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達，并對pH敏感，而且在pH5.0-6.5之間EGFP熒光強度與pH值呈線性相關(guān)。當(dāng)細胞外界pH降低至6.2以下時，M2離子通道打開，H+經(jīng)M2離子

5、通道迅速進入胞內(nèi)，致使細胞內(nèi)pH值下降，GFP的熒光值也隨之下降。本研究通過熒光測定儀synergy HT(BIO-TEK)檢測M2表達和無M2表達的細胞內(nèi)的熒光強度在低pH緩沖液中的變化情況。結(jié)果表明，M2表達細胞內(nèi)熒光強度的下降速度明顯比無M2表達細胞快，而且M2表達細胞內(nèi)熒光強度的下降速度可被金剛烷胺抑制。通過分析細胞外緩沖液pH、M2表達水平、細胞數(shù)量、細胞本身的Na+/k+通道等因素對分析方法的影響，初步建立和優(yōu)化了以pH敏感

6、的EGFP為指示劑的M2離子通道阻斷劑篩選法。在低pH緩沖液中，當(dāng)化合物阻斷M2離子通道時，H+通過M2離子通道進入細胞的速度下降，細胞內(nèi)的pH值下降減緩， EGFP的熒光值下降則隨之減緩。通過分析低pH緩沖液處理前后細胞內(nèi)GFP熒光強度下降速度的變化，可以判斷該化合物是否可以有效阻斷M2離子通道，并通過GraphPad Prism分析計算化合物阻斷M2離子通道的IC50值。結(jié)果表明，利用pH敏感的EGFP作為指示劑的M2離子通道篩選方

7、法所得的金剛烷胺和金剛乙胺的IC50值分別為3.099±1.688μmol/L，和0.2588±0.1376μmol/L，與文獻報道基本一致；利用該方法對本院合成的一些化合物庫進行了篩選，得到一些可以阻斷野生型H5M2離子通道的化合物，這些化合物的抗流感病毒活性進一步在MDCK細胞中通過病毒抑制試驗進行了驗證，二者結(jié)果基本一致。 總之，本研究在T-REx293細胞中建立了A型流感病毒M2離子通道模型，并利用pH敏感的綠色熒光蛋白