木黃銅誘導(dǎo)人喉癌細(xì)胞系Hep-2凋亡及抑制其增殖的研究.pdf

1、目的:喉癌是全人類第11種常見的惡性腫瘤，主要來源喉部粘膜上皮組織。喉癌在病理組織學(xué)上，絕大部分為鱗狀上皮細(xì)胞。治療喉癌的傳統(tǒng)方法主要是手術(shù)，放療或輔助治療。雖然手術(shù)切除病灶是治療喉癌的直接手段，但術(shù)后要面對(duì)局部腫瘤高復(fù)發(fā)率的風(fēng)險(xiǎn)或是因發(fā)音和吞咽功能障礙所帶來的較差的生活質(zhì)量。尋求一種可以使腫瘤縮小，減小切除范圍，降低復(fù)發(fā)率及提高患者生活質(zhì)量和生存率的新化療輔助藥物顯得日益重要。細(xì)胞凋亡也稱細(xì)胞程序性死亡，其過程是由大量相關(guān)因子和信號(hào)通

2、路共同參與，并嚴(yán)格調(diào)控的，是確保機(jī)體穩(wěn)態(tài)，維持組織和器官形態(tài)正常必不可少的條件。異常的調(diào)亡途徑常常會(huì)引起人類各種疾病，其中包括腫瘤。逃脫細(xì)胞凋亡不僅是腫瘤的常見特征也是腫瘤對(duì)化療藥物形成抵抗的形成原因。因此，那些可以通過阻斷或抑制細(xì)胞增殖引起細(xì)胞凋亡的藥物極有可能成為抗腫瘤藥物。木黃酮(Genistein)，化學(xué)名為4、5、7-三羥基異黃酮，是從廣泛存在自然界的豆科植物中發(fā)現(xiàn)的一種具有天然生物活性的黃酮類化合物。攝入木黃酮后對(duì)機(jī)體除了產(chǎn)

3、生以抗腫瘤為主的重要生物效應(yīng)以外，還具有抑制骨質(zhì)疏松形成、預(yù)防心血管疾病發(fā)生及減少絕經(jīng)后不良反應(yīng)等多種衛(wèi)生保健作用。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)木黃酮在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用。它的主要抗腫瘤機(jī)制為:1.調(diào)控細(xì)胞周期:經(jīng)木黃酮處理后，大部分腫瘤細(xì)胞能夠出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯，可能與木黃酮可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白(cyclin B)、CDKIs(p21WAF1)在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量有關(guān)。2.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡:用各種標(biāo)志性檢測(cè)細(xì)胞凋亡的技術(shù)方法，可

4、以觀察到經(jīng)木黃酮干預(yù)后的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡， caspase-3的激活， Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)量下降及Bax高表達(dá)等為其主要分子機(jī)制。3.調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移:木黃酮可以從抑制FAK的磷酸化，選擇性抑制MMPs，抑制TGF-β信號(hào)途徑等多種途徑，影響細(xì)胞粘附、遷移及侵襲。4.作為植物性雌激素:因?yàn)橛兄c17-β-雌二醇相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其具有部分雌激素作用，可以與雌激素受體結(jié)合，近而影響性激素介導(dǎo)的腫瘤的生長(zhǎng)（乳腺癌、前列腺癌

5、等）。5.其他:影響VEGF的表達(dá)，抗血管形成;清除自由基，減少或防止活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷，實(shí)現(xiàn)抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)旨在以人喉癌細(xì)胞系Hep-2為研究對(duì)象，通過倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、CCK-8試劑盒、流式細(xì)胞術(shù)等方法和技術(shù)觀察木黃酮對(duì)人類喉癌細(xì)胞系Hep-2抑制細(xì)胞周期和增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，從而為木黃酮應(yīng)用于臨床中喉部腫瘤的治療提供一些實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　1、在體外適宜條件下培養(yǎng)人喉癌細(xì)胞系Hep-2，并給

6、予不同濃度的木黃酮進(jìn)行干預(yù)。
　　2、通過CCK-8試劑盒檢測(cè)木黃酮對(duì)喉癌細(xì)胞增殖的抑制程度。
　　3、分別在倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察經(jīng)木黃酮干預(yù)后細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及生長(zhǎng)情況等方面的變化。
　　4、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)木黃酮對(duì)細(xì)胞周期各時(shí)相分布的影響和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。
　　5、應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)木黃酮引起人喉癌細(xì)胞系Hep-2中Bcl-2 mRNA、Survivin mRNA表達(dá)量的改變。

7、r>　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析和統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)+s)表示。比較兩樣本均數(shù)選擇t檢驗(yàn)。用單因素方差分析進(jìn)行多樣本均數(shù)間的比較，若有顯著性差異，接著用LSD法進(jìn)行兩兩比較。所有比較結(jié)果，當(dāng)P＜0.05時(shí)則可認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:倒置相差顯微鏡下觀察喉癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:空白對(duì)照組中的Hep-2細(xì)胞飽滿，細(xì)胞形態(tài)輪廓清晰，呈梭形、多邊形、上皮細(xì)胞樣，良好的貼壁生

8、長(zhǎng)，在培養(yǎng)液中未見明顯懸浮細(xì)胞。給予木黃酮干預(yù)的細(xì)胞胞漿濃縮，邊緣不規(guī)則，可見部分細(xì)胞表面有出芽現(xiàn)象，一些溶解破碎細(xì)胞及脫落的懸浮細(xì)胞。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明木黃酮可以明顯抑制喉癌細(xì)胞的增殖，隨著藥物濃度的增加，其抑制率不斷上升，有顯著的劑量依賴關(guān)系。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明:木黃酮可以引起細(xì)胞G2期阻滯，當(dāng)藥物濃度增加時(shí)會(huì)出現(xiàn)S期阻滯，并伴隨著G1期細(xì)胞比例的下降。喉癌細(xì)胞經(jīng)12μg/ml木黃酮干預(yù)24小時(shí)后，其G2期及S期的細(xì)胞累積量

9、明顯增多，分別與對(duì)照組相比較，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不僅如此，木黃酮還能誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而且隨著藥物濃度增加和作用時(shí)間的累積，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸上升，呈明顯的時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。相同作用時(shí)間，不同濃度木黃酮作用于喉癌細(xì)胞后所誘導(dǎo)的凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），相同濃度的木黃酮分不同時(shí)間長(zhǎng)度作用喉癌細(xì)胞后，其出現(xiàn)的凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以檢測(cè)到:Bcl-2 mRNA、

10、Survivin mRNA在經(jīng)過木黃酮處理后的喉癌細(xì)胞中表達(dá)量下降，分別與對(duì)照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、木黃酮能夠?qū)戆┘?xì)胞系Hep-2的增殖具有抑制作用，而且抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)。
　　2、木黃酮可以使喉癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，主要阻滯在G2期;隨著藥物濃度，處于S期的細(xì)胞百分比例也有明顯上升。阻滯細(xì)胞周期可能是木黃酮誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞系Hep-2凋亡的一種作用機(jī)制。