低氧微環(huán)境對(duì)體外培養(yǎng)hep-2頭頸鱗癌細(xì)胞系CSC增殖與分化的影響.pdf

1、頭頸鱗癌是人體常見惡性腫瘤，具有發(fā)病隱匿、侵襲性強(qiáng)、容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移以及預(yù)后差的特點(diǎn)。盡管近年來治療技術(shù)不斷進(jìn)步，治療后生活質(zhì)量有所改善，但生存率并沒有得到明顯提高。頭頸鱗癌死亡率高的主要原因是治療抵抗、局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療抵抗和復(fù)發(fā)一直是頭頸鱗癌治療中的一個(gè)難點(diǎn)和尚未徹底解決的問題。深入研究頭頸鱗癌的生物學(xué)特性、治療抵抗發(fā)生的機(jī)理，是尋求更加有效的治療手段，消除或減低頭頸鱗癌治療抵抗的關(guān)鍵所在。
　　 新近的研究證明，腫瘤的

2、起源和生長可能是由腫瘤組織內(nèi)少部分處于靜止期，具有自我更新和分化能力的細(xì)胞群體所維持，由于這部分細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，所以被稱為腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells，CSC)。國內(nèi)外學(xué)者己證明包括頭頸鱗癌在內(nèi)的多種腫瘤中確實(shí)存在CSC，這一事實(shí)為從CSC的角度研究頭頸鱗癌治療抵抗機(jī)理及改善治療效果提供了新的思路和切入點(diǎn)。
　　 氧缺乏能夠誘導(dǎo)一系列的細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)及分子生物學(xué)變化，進(jìn)而改變細(xì)胞的正常增殖、凋亡及損傷修復(fù)等

3、進(jìn)程。腫瘤微環(huán)境低氧這一因素被認(rèn)為是包括頭頸鱗癌在內(nèi)多種實(shí)體惡性腫瘤產(chǎn)生治療抵抗的主要原因，與腫瘤的治療后復(fù)發(fā)、治療效果差和不良預(yù)后直接相關(guān)。低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)作為一種低氧依賴的核轉(zhuǎn)錄蛋白，是腫瘤組織供氧和供能的中心調(diào)控因子，是腫瘤適應(yīng)低氧微環(huán)境和誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)并克服缺氧這一不利因素的中間環(huán)節(jié)，同時(shí)參與下游多個(gè)靶基因表達(dá)的調(diào)控，成為研究腫瘤微環(huán)境低氧狀態(tài)的重要靶基因。
　　

4、 腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞中的一個(gè)亞群，與分化成熟的腫瘤細(xì)胞共處相同環(huán)境中，腫瘤生長局部微環(huán)境中的低氧狀態(tài)使得CSC也必然生活于低氧微環(huán)境中。那么低氧微環(huán)境是否會(huì)影響CSC的增殖和分化，低氧微環(huán)境介導(dǎo)的治療抵抗是否與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)就成為我們的關(guān)注點(diǎn)。本項(xiàng)研究從低氧微環(huán)境和腫瘤干細(xì)胞入手，研究低氧微環(huán)境對(duì)喉癌hep-2細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞增殖分化的影響及其機(jī)制，并進(jìn)一步探討低氧所介導(dǎo)的化療抵抗與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系。
　　 第一部分低氧微

5、環(huán)境對(duì)hep-2細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞表型的影響
　　 目的：檢測低氧微環(huán)境中hep-2細(xì)胞的CD133表型、增殖、凋亡、細(xì)胞周期及相關(guān)基因(HIF-1α)表達(dá)的變化，探討低氧微環(huán)境對(duì)hep-2細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞表型的影響，并進(jìn)一步分析其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：
　　 1 低氧及常氧環(huán)境培養(yǎng)hep-2細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測常氧及低氧培養(yǎng)不同時(shí)間(6h、12h、24h、36h、48h)后細(xì)胞的CD133表型變化。
　　

6、2 低氧及常氧環(huán)境培養(yǎng)hep-2細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞的增殖曲線。
　　 3 低氧及常氧環(huán)境培養(yǎng)hep-2細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的周期和凋亡情況。
　　 4 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測低氧及常氧培養(yǎng)環(huán)境下hep-2細(xì)胞的克隆形成情況。
　　 5 低氧及常氧環(huán)境培養(yǎng)hep-2細(xì)胞，RT-PCR法檢測細(xì)胞中HIF-1α mRNA表達(dá)情況。
　　 6 低氧及常氧環(huán)境培養(yǎng)hep-2細(xì)胞，Western blot法檢

7、測細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1 CD133在常氧及低氧環(huán)境下培養(yǎng)的hep-2細(xì)胞中均有陽性表達(dá)，常氧環(huán)境中培養(yǎng)的hep-2細(xì)胞中表達(dá)率為0.82±0.13％，而在低氧環(huán)境中培養(yǎng)表達(dá)率增高，在不同時(shí)間(6h、12h、24h、36h、48h)的表達(dá)率分別為1.41±0.11％、5.16±0.23％、2.43±0.15％、2.07±0.33％、1.05±0.23％。
　　 2 經(jīng)MTT法檢測

8、發(fā)現(xiàn)：低氧組hep-2細(xì)胞的增殖活性顯著高于常氧組。
　　 3 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)：低氧組hep-2細(xì)胞的凋亡率顯著低于常氧組的凋亡率，并出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯。
　　 4 經(jīng)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)：hep-2細(xì)胞在低氧環(huán)境培養(yǎng)克隆形成率較高，為15.63±3.15％；而常氧環(huán)境培養(yǎng)克隆形成率為9.34±2.46％。
　　 5 經(jīng)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)：低氧組和常氧組hep-2細(xì)胞的HIF-1α mRNA

9、表達(dá)沒有明顯變化。
　　 6 經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：低氧組的HIF-1α蛋白表達(dá)較常氧組明顯增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：低氧微環(huán)境可以誘導(dǎo)和強(qiáng)化hep-2細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性，其作用可能與HIF-1α蛋白的表達(dá)變化相關(guān)。
　　 第二部分人HIF-1αRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及HIF-1α,基因敲除hep-2細(xì)胞系的建立
　　 目的：建立人HIF-1α RNA干擾質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染人喉鱗癌hep-2細(xì)胞，建立

10、人喉鱗癌hep-2細(xì)胞HIF-1α基因敲除細(xì)胞系，并進(jìn)一步分析該基因敲除細(xì)胞系中HIF-1α基因的表達(dá)變化。
　　 方法：
　　 1 設(shè)計(jì)合成針對(duì)人HIF-1α基因的siRNA序列，退火后與pGPU6/Hygro質(zhì)粒連接，構(gòu)建pGPU6/Hygro-HIF-RNAi重組質(zhì)粒。
　　 2 采用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人喉癌hep-2細(xì)胞，抗生素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
　　 3 應(yīng)用RT-PCR和Western

11、 blot方法檢測HIF-1α表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1 成功構(gòu)建pGPU6/Hygro-HIF-RNAi重組質(zhì)粒和人喉癌hep-2細(xì)胞HIF-1α基因敲除細(xì)胞模型。
　　 2 經(jīng)RT-PCR和Western blot法檢測HIF-1α基因在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均有明顯下降。
　　 結(jié)論：pGPU6/Hygro-HIF-RNAi重組質(zhì)粒能有效轉(zhuǎn)染人喉癌hep-2細(xì)胞并下調(diào)HIF-1α基因的表達(dá)，為

12、后續(xù)研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分 HIF-1α基因敲除對(duì)hep-2細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞表型的影響
　　 目的：檢測HIF-1α基因敲除后hep-2細(xì)胞的CD133表型、增殖、凋亡、細(xì)胞周期的變化，探討HIF-1α基因?qū)ep-2細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞表型的影響。
　　 方法：
　　 1 流式細(xì)胞術(shù)檢測hep-2細(xì)胞和HIF-1α基因敲除hep-2細(xì)胞低氧培養(yǎng)不同時(shí)間(12h和24h)后細(xì)胞的CD133表

13、型變化。
　　 2 MTT法檢測低氧環(huán)境培養(yǎng)的hep-2細(xì)胞和HIF-1α基因敲除hep-2細(xì)胞的增殖情況。
　　 3 流式細(xì)胞術(shù)檢測低氧環(huán)境培養(yǎng)hep-2細(xì)胞和HIF-1α基因敲除hep-2細(xì)胞的周期和凋亡情況。
　　 4 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測低氧培養(yǎng)環(huán)境下hep-2細(xì)胞和HIF-1α基因敲除hep-2細(xì)胞的克隆形成情況。
　　 結(jié)果：
　　 1 低氧環(huán)境下培養(yǎng)12小時(shí)和24小時(shí)的hep-2細(xì)

14、胞和HIF-1α基因敲除hep-2細(xì)胞中均有CD133陽性表達(dá)，其中hep-2細(xì)胞中表達(dá)率為5.16±0.23％和2.43±0.15％，而HIF-1α基因敲除后其表達(dá)下調(diào)，表達(dá)率分別約為1.86±0.15％和1.21±0.13％
　　 2 經(jīng)MTT法檢測發(fā)現(xiàn)：HIF-1α基因敲除后hep-2細(xì)胞的增殖活性明顯降低。
　　 3 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)：HIF-1α基因敲除后hep-2細(xì)胞的凋亡率升高，并且G0/G1期阻滯變化

15、不明顯。
　　 4 經(jīng)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)：hep-2細(xì)胞在低氧環(huán)境中培養(yǎng)克隆形成率為15.63％，而HIF-1α基因敲除后克隆形成率降低，為11.96％
　　 結(jié)論：HIF-1α基因敲除能夠削弱由低氧微環(huán)境所誘導(dǎo)和強(qiáng)化的hep-2細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性，HIF-1α基因在低氧微環(huán)境誘導(dǎo)的hep-2細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的富集具有重要作用，HIF-1α可能參與腫瘤干細(xì)胞的生長調(diào)控。
　　 第四部分 HIF-1α在CD

16、133+細(xì)胞增殖及順鉑殺傷中的作用
　　 目的：探討HIF-1α在低氧培養(yǎng)CD133+細(xì)胞生長分化及DDP治療抵抗中作用，并初步研究其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1 流式細(xì)胞儀分選hep-2細(xì)胞和HIF-1α基因敲除hep-2細(xì)胞中的CD133+細(xì)胞。
　　 2 有限稀釋法檢測低氧培養(yǎng)CD133+細(xì)胞克隆形成情況。
　　 3 MTT法檢測低氧培養(yǎng)DDP對(duì)CD133+細(xì)胞增殖抑制情況。
　

17、　 4 流式細(xì)胞術(shù)檢測低氧培養(yǎng)CD133+細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)情況
　　 結(jié)果：
　　 1 采用流式細(xì)胞分選術(shù)成功分選不同hep-2細(xì)胞中CD133+細(xì)胞
　　 2 有限稀釋法檢測CD133+細(xì)胞克隆形成情況，低氧培養(yǎng)hep-2細(xì)胞中CD133+細(xì)胞克隆形成率較高，為85.35±3.34％；而HIF-1α基因敲除后CD133+細(xì)胞的克隆形成率降低，為50.43±5.12％。
　　 3 MTT法檢測低氧培養(yǎng)

18、順鉑對(duì)不同CD133+細(xì)胞的增殖抑制情況，發(fā)現(xiàn)順鉑對(duì)HIF-1α,基因敲除hep-2細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的增殖抑制作用較強(qiáng)。
　　 4 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測低氧培養(yǎng)hep-2細(xì)胞及HIF-1α基因敲除hep-2細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的相關(guān)基因（Oct-4、suvivin及p53）表達(dá)情況，hep-2細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的Oct-4、p53及Survivin蛋白表達(dá)熒光指數(shù)分別為3.64±0.21、0.88±0.16和1.39±

19、0.23;HIF-1α基因敲除hep-2細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的Oct-4、p53及Survivin蛋白表達(dá)熒光指數(shù)分別為2.23±0.15、1.25±0.11和1.07±0.17。
　　 結(jié)論：低氧培養(yǎng)下hep-2細(xì)胞中CD133+細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖分化活性和DDP治療抵抗能力，HIF-1α基因敲除后CD133+細(xì)胞的增殖分化能力和DDP治療抵抗能力有所下降，伴隨著Oct-4、p53和Survivin表達(dá)變化。HIF-1α參與