靶向OCT4的microRNA系統(tǒng)性篩選及對泌尿系腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 OCT4靶向miRNA的系統(tǒng)性篩選
　　目的：從目前已知的人類miRNA中篩選出能特定靶向結(jié)合到OCT43’UTR端，并能引起OCT4表達(dá)下調(diào)的miRNA。
　　方法：應(yīng)用多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測OCT43’UTR的靶向miRNA，然后通過構(gòu)建OCT4-3’UTR熒光素酶報告基因系統(tǒng)質(zhì)粒，同預(yù)測的miRNA共轉(zhuǎn)染檢測相對熒光素酶活性；隨后將篩選出的miRNA轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞系

2、內(nèi)，選擇出能下調(diào)OCT4表達(dá)的miRNA；構(gòu)建OCT43’UTR突變體熒光素酶報告基因系統(tǒng)質(zhì)粒，同相應(yīng)的miRNA共轉(zhuǎn)染后檢測相對熒光素酶活性，得到通過結(jié)合OCT43’UTR下調(diào)OCT4表達(dá)的miRNA
　　結(jié)果：應(yīng)用軟件TargetScan預(yù)測結(jié)果有7-8個堿基可配對結(jié)合，4個miRNA結(jié)合強(qiáng)度為conserved，50個miRNA結(jié)合強(qiáng)度為poorly conserved；miRDB以默認(rèn)參數(shù)對結(jié)合能力評分排序，得到7個miR

3、NA；miRanda以默認(rèn)參數(shù)預(yù)測評分，得到11個miRNA；miRWalk與Pictar軟件未得出有意義的結(jié)果。合并后預(yù)測出61個miRNA與OCT4的3’UTR有結(jié)合能力；其中有1個（1.6％）miRNA同時為3個軟件所預(yù)測，9個（14.8％）miRNA同時為2個軟件所預(yù)測，51個（83.6％）僅為1個軟件所預(yù)測。構(gòu)建雙熒光素酶報告系統(tǒng)，驗證出20個miRNA改變了其表達(dá)的熒光素酶相對活性；通過在膀胱癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染mimics后的W

4、estern blot檢測，結(jié)合8個miRNA與構(gòu)建的突變體驗證結(jié)果，最終3個miRNA被確認(rèn)通過完整的篩選流程。
　　結(jié)論：應(yīng)用靶向OCT4的miRNA篩選流程：首先多個生物信息學(xué)預(yù)測軟件預(yù)測，隨后熒光素酶報告系統(tǒng)驗證，檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞后OCT4基因的表達(dá)，最后構(gòu)建突變體驗證，能高效迅速地篩選出靶向OCT4的miRNA，有較好的效價比易于在實驗室應(yīng)用開展。
　　第二部分 miRNA靶向OCT4抑制膀胱癌細(xì)胞系活性與增殖

5、　　目的：研究膀胱癌組織和細(xì)胞中的OCT4表達(dá)同臨床病理的聯(lián)系；研究膀胱癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miRNA后生物學(xué)行為的改變，在細(xì)胞水平驗證miRNA具體功能并探討其發(fā)生的機(jī)制
　　方法：應(yīng)用免疫組化和實時定量PCR，檢測膀胱癌組織中OCT4的表達(dá)；將篩選出靶向結(jié)合OCT43‘UTR的miRNA分別轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞系，觀察其靶基因OCT4的表達(dá)情況，觀察膀胱癌細(xì)胞系5637和HT-1376細(xì)胞活性MTS吸光值變化及集落形成能力的改變。
　

6、　結(jié)果：檢測的31例膀胱癌石蠟標(biāo)本組織中有83.9％有表達(dá)，16對膀胱癌與癌旁組織中膀胱癌組織OCT4平均表達(dá)高于正常組織64倍。分別轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后，5637和HT1376細(xì)胞中的OCT4表達(dá)下調(diào)；MTS細(xì)胞活性檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后的5637細(xì)胞72小時相對吸光值A(chǔ)492分別為1.20±0.04、1.10±0.03、0.96±0.03與NC對照組1

7、.43±0.05相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后的HT-1376細(xì)胞72小時相對吸光值A(chǔ)492分別為0.85±0.02、0.71±0.02、0.62±0.03，與NC對照組1.30±0.03相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；集落形成實驗顯示，轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后的5637細(xì)胞按每孔1000種板培養(yǎng)10天后集落形成的數(shù)量分別為361.8±45.16、262.3±33.1

8、2、412.5±35.71，同對照組NC540.3±32.48相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；轉(zhuǎn)染miR-335、miR-4654、miR-3657后的HT-1376細(xì)胞按每孔500種板培養(yǎng)14天后集落形成的數(shù)量分別為209.5±31.78、171.3±19.76、206.3±14.51，同對照組NC的304.8±16.57相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：miR-335、miR-4654、miR-3657能通過靶向OCT4抑制膀胱癌細(xì)胞系

9、5637和HT-1376的細(xì)胞活性，抑制其增殖。
　　第三部分 miR-335靶向OCT4調(diào)控ACHN腎癌腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為
　　目的：研究miR-335在細(xì)胞水平靶向OCT4并調(diào)控ACHN腎癌腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)行為
　　方法：以CD105為標(biāo)記物在腎癌細(xì)胞系中篩選、培養(yǎng)并鑒定出CD105+ACHN腫瘤干細(xì)胞，利用慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-335并建立細(xì)胞株。檢測細(xì)胞株的OCT4的表達(dá)，觀察miR-335影響ACHN

10、 CD105+腫瘤干細(xì)胞的成球能力、細(xì)胞周期的改變，以及細(xì)胞形態(tài)及劃痕實驗中細(xì)胞遷移能力的變化。
　　結(jié)果：以CD105+為標(biāo)記成功篩選建立腎癌腫瘤干細(xì)胞株，檢測其干細(xì)胞表面標(biāo)志物：Sox-2/c-Myc/Nanog/OCT4/CD44/nestin/Pax2/DLK/CXCR4/Musashi均呈現(xiàn)高表達(dá)，24小時和48小時順鉑處理的ACHN CD105+細(xì)胞其增殖活性明顯高于ACHN CD105-細(xì)胞；細(xì)胞周期檢測ACHN C

11、D105+相對于ACHN CD105-細(xì)胞G0期明顯延長（6.3％vs2.27％）。MiR-335穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后ACHN CD105+腫瘤干細(xì)胞OCT4表達(dá)減低，部分干細(xì)胞特性隨之減弱或消失，miR-335穩(wěn)轉(zhuǎn)腫瘤干細(xì)胞株的成球能力下降，每1000細(xì)胞成球數(shù)量同ACHN CD105+細(xì)胞成球數(shù)量差別有統(tǒng)計學(xué)意義，細(xì)胞周期G0期縮短（2.9％vs6.3％），細(xì)胞形態(tài)變化細(xì)胞突起和偽足減少，劃痕實驗中穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-335后ACHN CD105+細(xì)