耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌分子流行病學(xué)及MALDI-TOF MS在碳青霉烯耐藥決定子快速檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌是臨床分離率占前四位的革蘭陰性桿菌。碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥革蘭陰性桿菌的出現(xiàn)和流行，給臨床抗感染治療和醫(yī)院內(nèi)感染控制帶來(lái)了極大困難?；诜肿臃中图夹g(shù)的分子流行病學(xué)研究可明確菌株的流行情況和變化趨勢(shì)，為感染防控措施的制定提供科學(xué)依據(jù);革蘭陰性菌碳青霉烯類(lèi)耐藥決定子的快速檢測(cè)可為臨床感染性疾病的診治爭(zhēng)取寶貴時(shí)間。
　　本研究首先對(duì)近年來(lái)我院出現(xiàn)的碳青霉烯類(lèi)耐藥的重要革蘭陰性桿菌的流行情

2、況、耐藥機(jī)制及歷年來(lái)的變遷進(jìn)行調(diào)查。受試菌株包括2009年-2012年浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院分離的碳青霉烯類(lèi)耐藥或敏感性降低的16株大腸埃希菌、87株肺炎克雷伯菌、80株鮑曼不動(dòng)桿菌和67株銅綠假單胞菌。藥物敏感性試驗(yàn)顯示多黏菌素B和黏菌素對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥菌株具有強(qiáng)大的抗菌活性，其次為阿米卡星。產(chǎn)碳青霉烯酶是革蘭陰性桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的主要原因。大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌所產(chǎn)碳青霉烯酶以KPC-2為主，鮑曼不動(dòng)桿菌主要

3、產(chǎn)OXA-23型碳青霉烯酶。對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥菌株進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分析發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌的醫(yī)院內(nèi)克隆傳播較為嚴(yán)重。肺炎克雷伯菌從2009年到2012年期間，一直存在KP-A型優(yōu)勢(shì)克隆株縱向傳播現(xiàn)象;銅綠假單胞菌的克隆傳播現(xiàn)象不明顯，但自2010年以來(lái)，PA-A型克隆株一直在我院傳播。鮑曼不動(dòng)桿菌各年份內(nèi)橫向傳播現(xiàn)象較嚴(yán)重，而各年份之間沒(méi)有同一優(yōu)勢(shì)克隆株。多位點(diǎn)序列分型(MLST)顯示，ST131和ST11分別是大

4、腸埃希菌和肺炎克雷伯菌主要的ST型;銅綠假單胞菌以ST463最為常見(jiàn);鮑曼不動(dòng)桿菌的ST型分布較為分散，但幾個(gè)主要的ST型均屬于克隆復(fù)合群208(CC208)。除了產(chǎn)碳青霉烯酶，高產(chǎn)ESBLs或AmpC酶合并膜孔蛋白缺失是導(dǎo)致腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥的另一主要原因。
　　以上述結(jié)果為基礎(chǔ)，本研究采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)建立了可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)革蘭陰性桿菌碳青霉烯耐藥決定子

5、的方法。用MALDI-TOF MS對(duì)50株革蘭陰性桿菌進(jìn)行碳青霉烯酶檢測(cè)，整個(gè)過(guò)程僅需2小時(shí)左右，且操作簡(jiǎn)便，試劑成本非常低，適合大樣本量檢測(cè)。提取10株大腸埃希菌和8株肺炎克雷伯菌的外膜蛋白用MALDI-TOF MS檢測(cè)，肺炎克雷伯菌主要缺失質(zhì)荷比為37，000和38，000的質(zhì)譜峰，大腸埃希菌同樣主要缺失這兩個(gè)質(zhì)譜峰。與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)相比，大腸埃希菌外膜蛋白MALDI-TOF MS缺失的37，

6、000-和38，000-m/z的質(zhì)譜峰分別對(duì)應(yīng)SDS-PAGE的40kDa和41kDa條帶;肺炎克雷伯菌外膜蛋白MALDI-TOF MS缺失的38，000-m/z的質(zhì)譜峰對(duì)應(yīng)SDS-PAGE的42kDa條帶，37kDa的質(zhì)譜峰在SDS-PAGE上未顯示;為了驗(yàn)證MALDI-TOF MS所缺失質(zhì)譜峰與SDS-PAGE所缺失條帶的關(guān)系，我們對(duì)SDS-PAGE膠上的目的條帶進(jìn)行胰酶水解，并用MALDI-TOF/TOF MS進(jìn)行分析及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)

7、，結(jié)果證明大腸埃希菌外膜蛋白MALDI-TOF MS所缺失的37，000-和38，000-m/z質(zhì)譜峰分別對(duì)應(yīng)SDS-PAGE上的40kDa的OmpF和41kDa的OmpC，肺炎克雷伯菌外膜蛋白MALDI-TOF MS所缺失的38，600-m/z質(zhì)譜峰對(duì)應(yīng)SDS-PAGE上的42kDa的OmpK36。與SDS-PAGE相比，MALDI-TOF MS具有操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，分辨率高，影響因素少，結(jié)果易于觀察等優(yōu)點(diǎn)。
　　綜上所述，碳青