HMME介導(dǎo)的光動力療法制備鼠肝癌細(xì)胞MM45T-Li疫苗的研究.pdf

1、光動力療法(Photodynamic therapy，PDT)是一種治療惡性腫瘤和某些良性增生性疾病的新方法。光動力療法在對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接的殺傷作用同時，還可以增強(qiáng)宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)。目前已有研究建立了光動力療法制備腫瘤疫苗的方法，但對于光動力療法制備肝癌疫苗的研究并不多見。本研究以鼠肝癌細(xì)胞MM45T-Li為研究模型，探討利用光動力療法制備肝癌疫苗的抗瘤效應(yīng)，為肝癌的免疫治療提供一種新的途徑。
　　目的：
　　1.探討

2、光動力療法在體外對鼠肝癌細(xì)胞MM45T-Li的殺傷作用特點，以尋找光動力療法制備疫苗的作用參數(shù)。
　　2.分析光動力療法制備的腫瘤疫苗對小鼠肝癌移植瘤的體內(nèi)預(yù)防保護(hù)和治療作用，比較不同光照劑量對PDT制備細(xì)胞疫苗的影響。
　　3.探討光動力療法制備腫瘤細(xì)胞疫苗對小鼠體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)的影響。
　　方法：
　　1.利用熒光顯微鏡觀察不同濃度HMME在MM45T-Li細(xì)胞中的吸收；多功能酶標(biāo)儀定量分析細(xì)胞內(nèi)HMME在

3、不同時間點的熒光強(qiáng)度；共聚焦顯微鏡觀察HMME在MM45T-Li細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位；在以HMME為光敏劑，630nm激光為光源的PDT作用于細(xì)胞，MTT法檢測光動力療法對細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。Hoechst細(xì)胞核熒光染色法觀察光動力療法對細(xì)胞核形態(tài)的改變。AnnexinV-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測光動力療法檢測光動力療法誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　2.在功率密度為1.5mw/cm2的條件下，利用不同能量密度的光動力療法作用細(xì)胞24

4、h后提取細(xì)胞裂解液作為腫瘤疫苗。以生理鹽水作為對照，反復(fù)凍融法制備的疫苗為陽性對照。疫苗免疫小鼠后建立小鼠肝癌模型，觀察腫瘤體積變化。腫瘤生長至第16天，處死小鼠，稱量腫瘤重量，HE染色觀察腫瘤病理組織學(xué)變化。
　　3.免疫接種結(jié)束后7d，流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血T細(xì)胞亞群的變化。同時利用階梯密度離心法提取脾淋巴細(xì)胞，MTT法檢測體外淋巴細(xì)胞毒性。
　　4.檢測疫苗的治療作用：建立小鼠肝癌模型，疫苗免疫荷瘤小鼠，觀察腫瘤體積變化

5、。觀察周期為60天，計錄荷瘤小鼠生存期。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞內(nèi)HMME含量隨著光敏劑濃度及孵育時間的增加而增加。選擇4h孵育時間及濃度為20μg/ml的HMME作為PDT的最佳參數(shù)。共聚焦熒光顯微鏡顯示HMME分布在細(xì)胞核外，定位于線粒體。MTT檢測結(jié)果顯示PDT對細(xì)胞的殺傷率隨著光敏劑濃度和能量密度的增加而增加。當(dāng)HMME濃度為20μg/ml，光照劑量為2.7 J/cm2時，PDT對細(xì)胞的殺傷率30.21％；光照劑量

6、為7.2J/cm2時，殺傷率達(dá)90.65％。Hoechst染色觀察PDT作用24h后部分細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)凝集、核固縮、核碎裂等形態(tài)學(xué)改變。AnnexinV/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示在能量密度為0.9至4.5J/cm2時，PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡隨著能量密度的增加而增加，最到達(dá)30.5±4.2％；當(dāng)能量密度增加至7.2J/cm2時，細(xì)胞以壞死為主，凋亡率下降為4.1±2.7％。
　　2.依據(jù)PDT的殺傷效果，選擇能量密度為2.7和7.2

7、J/cm2的光照劑量制備疫苗。在疫苗對荷瘤小鼠的預(yù)防保護(hù)實驗中，與對照組相比，2.7J/cm2PDT組疫苗的腫瘤生長緩慢，腫瘤的體積及重量明顯降低。對腫瘤體積的抑制率最高為59.8％。而大劑量7.2J/cm2PDT組中的腫瘤體積重量下降不明顯。各組腫瘤的病理組織表現(xiàn)無明顯差異。
　　3.與對照組比較，2.7J/cm2 PDT及7.2J/cm2PDT組疫苗可以明顯改善機(jī)體免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)外周血T細(xì)胞亞群CD4+/CD8+的比值

8、，增加NK細(xì)胞比例，同時增加脾淋巴細(xì)胞特異性細(xì)胞毒性。
　　4.在疫苗對荷瘤小鼠的治療實驗中，2.7J/cm2 PDT組疫苗的腫瘤生長緩慢，甚至消退，明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，并提高荷瘤小鼠生存率。
　　結(jié)論：
　　1.HMME介導(dǎo)的光動力療法可以有效殺傷鼠肝癌細(xì)胞MM45T-Li，誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與光照劑量密切相關(guān)。
　　2.光動力療法制備的肝癌細(xì)胞疫苗明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，具有預(yù)防保護(hù)和治療作用。小劑量