光動力療法聯(lián)合NK細胞對小鼠Heps肝癌的抑制作用及免疫效應的研究.pdf

1、目的：觀察自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)靜脈輸入后在荷Heps肝癌小鼠體內的分布規(guī)律；光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是否促進靜脈輸入的NK細胞在腫瘤組織內聚集；觀察聯(lián)合NK細胞后PDT對移植瘤的抑制作用及對宿主抗腫瘤免疫效應的影響，探討PDT聯(lián)合靜脈輸入的NK細胞治療小鼠Heps肝癌的療效和機制，為肝癌光免疫治療(photoimmunotherpy，PIT)的可行性提供實驗依

2、據。
　　方法：誘導擴增KM小鼠脾細胞來源的NK細胞，培養(yǎng)11天后收集NK細胞，同時以4，‘6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液(50ug/ml)混勻標記1小時。KM小鼠皮下接種Heps肝癌細胞建立小鼠移植瘤模型，接種后12d，選取皮下移植瘤直徑在0.8～1.2cm的小鼠128只，隨機分為對照組、光動力組(PDT組)、細胞組(NK組)和光免疫組(PIT組)，32只/組

3、。對照組：小鼠經尾靜脈輸入生理鹽水0.2ml/只；PDT組：小鼠尾靜脈注射光敏劑多替泊芬20mg/kg后24小時行PDT激光照射。照光前腹腔內注射鹽酸氯胺酮100mg/kg麻醉，8％硫化鈉腫瘤局部脫毛，小鼠側臥于照射板上，紅光照射腫瘤局部，連續(xù)照射15min，功率密度為200mW/cm2，能量密度為180J/cm2；NK組：小鼠尾靜脈輸注DAPI標記濃度為8×106/ml的NK細胞，0.2ml/只；PIT組：上述PD-T照光處理后即刻小

4、鼠尾靜脈輸注與NK組相同數量的NK細胞。(1)自治療當日起，隔日測量四組小鼠腫瘤長、短徑，計算治療后腫瘤體積變化，計算治療后16d各治療組抑瘤率；(2)記錄各組小鼠接種腫瘤至其死亡的時間，計算平均生存時間；(3)治療后1d、2d、4d、6d、8d，NK組和PIT組處死小鼠后快速摘取肝臟、脾臟、肺臟和腫瘤組織，制作細胞印片，熒光顯微鏡下觀察標記細胞在上述臟器的分布情況；(4)治療后2d觀察蘇木素-伊紅(hematoxylin-esosin

5、，HE)染色的瘤組織病理學改變；(5)治療后1d、2d、4d、6d，摘除小鼠眼球取血以流式細胞儀檢測外周血NK細胞含量變化；(6)治療后12h、1d、2d、4d、6d測定小鼠外周血T細胞亞群(CD4+T細胞、CD8+T細胞)變化；(7)治療后6d乳酸脫氫酶(lactate dehydr-ogenase，LDH)釋放法檢測小鼠脾細胞殺傷活性；(8)治療后12h、1d、2d、4d、6d、12d通過雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-

6、linked immunosorbent ass-ay，EL-ISA)，檢測干擾素(interferon，IFN)-γ的水平變化；(9)取治療后2d各組小鼠腫瘤組織切片，分別應用Bcl-2抗體、Bax抗體抗體，行免疫組織化學染色，計數局部腫瘤組織中Bcl-2陽性、Bax陽性細胞數量，計算Bax/Bcl-2。
　　結果：1.抑瘤率：治療后8d、16d，治療組較對照組腫瘤體積小(P<0.05)，其中，PIT組較PDT組、NK組腫瘤體積

7、明顯縮小(P<0.05)；PDT組、NK組、PIT組治療后16天的抑瘤率分別為56.43％、56.99％、80.51％，PIT組顯著高于PDT組和NK組。
　　2.生存時間：各治療組小鼠生存時間較對照組明顯延長(P<0.05)。PIT組較PDT組、NK組顯著延長(P<0.05)。
　　3.標記細胞宿主體內重要臟器分布：NK細胞輸入后1d～8d，在小鼠肝臟、脾臟、肺臟和腫瘤組織中均有分布，其中以腫瘤組織內聚集最多；標記細胞瘤內

8、浸潤密度，以輸入后2d最高，各時間點PIT組又顯著高于NK組(P<0.05)。
　　4.各組小鼠腫瘤HE染色：治療后2d，對照組腫瘤細胞呈彌漫性生長，細胞變性壞死及免疫細胞少見；NK組腫瘤組織呈灶性壞死，間質中可見較多淋巴細胞浸潤；PDT組可見瘤細胞核固縮，大片狀壞死，較多微血管破壞；PIT組腫瘤組織呈大片狀壞死，微血管破壞顯著，組織間可見大量紅細胞溢出，瘤內及其周圍(尤其血管損傷部位)可見大量淋巴細胞和少量中性粒細胞浸潤，免疫細

9、胞浸潤密度及腫瘤組織壞死面積均較NK組增多。
　　5.外周血中NK細胞：在治療后1d～6d，PIT組較對照組明顯增高(P<0.05)；治療后1d～4d，NK組較其余各組增高(P<0.05)。
　　6.外周血T細胞亞群：CD4+T細胞：NK組在治療后12h～4dCD4+T細胞一直維持在較高水平，上述時間點與PDT、對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，在治療后12h～2d，與PIT組也有明顯差異；治療后2dPIT組CD4+T細胞較對照組

10、、PDT組有顯著差異(P<0.05)；CD8+T細胞：PIT組、NK組在治療后1d～6d，PDT組在4d～6d較對照組CD8+T細胞增高(P<0.05)。PIT組在治療后1d～6d，NK組在治療后1d～4d較P-DT組明顯增高(P<0.05)。PIT組在治療后1d、2d、6d較NK組明顯增高(P<0.05)。
　　7.小鼠脾細胞殺傷活性：效靶比為10:1、20:1和50:1時，治療組脾細胞殺傷活性均顯著高于對照組，其中PIT組又顯

11、著高于NK組、PDT組(P<0.05)。
　　8.血清細胞因子IFN-γ：12h～6dNK組和PIT組，2d～6dPDT組小鼠血清IFN-γ濃度較對照組顯著增高(P<0.05)。1d～6dNK組和12h～6d PIT組較PDT組血清IF-N-γ濃度明顯升高(P<0.05)；12h，2d～6dPIT組又高于NK組(P<0.05)。
　　9.各組小鼠腫瘤Bcl-2-IHC、Bax-IHC染色：治療后2d，治療組Bcl-2蛋白表達

12、明顯低于對照組，PIT組又顯著低于NK組、PDT組(P<0.05)；治療組Bax蛋白表達明顯高于對照組，PIT組又顯著高于NK組、PDT組(P<0.05)。
　　結論：1.NK細胞經靜脈輸入荷瘤小鼠體內后在肺、肝、脾、腫瘤組織中均有分布，以腫瘤組織內為著；聯(lián)合PDT可增加NK細胞瘤內浸潤密度。
　　2.PDT和靜脈輸注的NK細胞均可促進外周血CD8+T細胞增殖活化，增強小鼠脾細胞殺傷活性，升高血清IFN-γ水平，下調瘤內Bc