NK4對淋巴瘤抑制作用的實(shí)驗研究.pdf

1、背景和目的 據(jù)UICC World Cancer Congress 2006報道，惡性腫瘤仍然是21世紀(jì)嚴(yán)重危害人類生命健康的主要疾病。全球年新發(fā)腫瘤病例約1100萬，死亡700萬，現(xiàn)患病例2500萬。以此趨勢，至2020年，每年新發(fā)病例將達(dá)1600萬，死亡1000萬。目前，我國年發(fā)病人數(shù)約200萬，死亡150萬；在城鎮(zhèn)居民中，惡性腫瘤仍是死亡的主要原因。 研究表明肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth fa

2、ctor，HGF)異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)。HGF作為一種多功能細(xì)胞因子，主要經(jīng)旁分泌(基質(zhì)細(xì)胞)或自分泌(腫瘤細(xì)胞)途徑產(chǎn)生，通過HGF/Met信號途徑，激活受體酪氨酸激酶，使下游的信號分子磷酸化，產(chǎn)生系列的生物學(xué)效應(yīng)，主要表現(xiàn)為絲裂原、能動原、形態(tài)發(fā)生原效應(yīng)和促血管新生，促進(jìn)腫瘤的生長、遷徙和侵襲。對霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤等研究發(fā)現(xiàn)HGF與淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展可能存在相互促進(jìn)關(guān)系：HGF

3、的高分泌促進(jìn)淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展，而淋巴瘤細(xì)胞的增殖又促進(jìn)HGF自分泌。還證實(shí)hGF水平與淋巴瘤的臨床療效、預(yù)后等密切相關(guān)，是一個值得進(jìn)一步研究的指標(biāo)。因此，阻斷HGF/Met系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能成為抗腫瘤治療的新策略之一。就現(xiàn)研究而言，NK4是理想的HGF/Met信號途徑阻斷劑，其機(jī)制在于能全面拮抗HGF活性。NK4是HGF的一個含447個氨基酸殘基的片段，保留了HGF與其受體c-MET的結(jié)合部位，能和HGF競爭性結(jié)合受體c-MET，但結(jié)

4、合后不能使后者發(fā)生磷酸化，從而抑制HGF的誘導(dǎo)腫瘤生長、侵襲、遷徙和促血管新生等生物活性。研究證實(shí)NK4具二重功能：HGF的抑制劑和非依賴于HGF的血管新生抑制劑，具腫瘤治療價值。對肺癌、大腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、纖維肉瘤等多種惡性腫瘤的研究證實(shí)，NK4具有顯著的抑瘤效應(yīng)，是HGF相關(guān)研究中的重點(diǎn)之一。 但迄今國內(nèi)外尚無NK4對淋巴瘤抑制作用的相關(guān)研究。 直接使用NK4蛋白和通過

5、載體介導(dǎo)NK4基因轉(zhuǎn)染后的表達(dá)是目前主要的研究方法。后者最為常用，根據(jù)導(dǎo)入方式分直接導(dǎo)入和轉(zhuǎn)染后導(dǎo)入兩種技術(shù)。直接導(dǎo)入法不需轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可直接進(jìn)行瘤內(nèi)或腹腔內(nèi)注射且可反復(fù)加強(qiáng)，但持續(xù)表達(dá)時間短。轉(zhuǎn)染后導(dǎo)入法需先構(gòu)建其表達(dá)載體，再以適當(dāng)方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后進(jìn)行體內(nèi)或體外實(shí)驗，雖操作復(fù)雜，但因轉(zhuǎn)染后可獲穩(wěn)定、高效表達(dá)，效果更理想。 因此，在本研究中我們試圖通過NK4基因轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，探索NK4對淋巴瘤的抑制作用。擬綜合應(yīng)用分子生物學(xué)

6、、細(xì)胞生物學(xué)、免疫組化等多項技術(shù)，如細(xì)胞培養(yǎng)、基因克隆、基因轉(zhuǎn)染、半固體培養(yǎng)、實(shí)時FQ-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、ELISA等，進(jìn)行相關(guān)工作。 方法 在第一部分，根據(jù)靶序列設(shè)計引物，采用RT-PCR，獲得NK4、c-MET和HGF的特異性目的片段，分別與載體pGEM-T Easy和pMD19-T Simple構(gòu)建相應(yīng)重組質(zhì)粒，作為定量標(biāo)準(zhǔn)；優(yōu)化反應(yīng)條件和組分濃度，分別建立NK4 mRNA、c-METmRNA和HGF mRNA

7、相應(yīng)的實(shí)時FQ-PCR，并進(jìn)行方法學(xué)評價。 在維持底層膠瓊脂糖濃度為0.5％的基礎(chǔ)上，對上層膠瓊脂糖濃度(0.1％～0.5％)和細(xì)胞濃度(100個/孔～5000個/孔)進(jìn)行選擇，改良瓊脂糖半固體培養(yǎng)體系。 根據(jù)真核載體pVITRO2 MCS2的酶切位點(diǎn)，設(shè)計引物，經(jīng)RT-PCR獲得NK4和HGF全長片段，與載體pMD19-T Simple重組，鑒定確認(rèn)序列正確后擴(kuò)大、提純，酶切后回收目的片段分別與和pVITRO2重組，構(gòu)

8、建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-HGFWhole。 在第二部分，重組質(zhì)粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-HGFWhole以陽離子脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，經(jīng)潮霉素B篩選、RT-PCR、ELISA和免疫細(xì)胞組化等方法，鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功與否；通過繪制生長曲線、觀察克隆形成能力和生長特點(diǎn)，評價NK4基因、HGF基因轉(zhuǎn)染對Raji細(xì)胞生物性狀的影響；采用實(shí)時FQ-PCR檢測轉(zhuǎn)

9、染細(xì)胞c-MET mRNA的表達(dá)變化；采用ELISA.檢測NK4基因、HGF基因轉(zhuǎn)染后的磷酸化c-MET蛋白的變化。綜合以上結(jié)果評價NK4基因轉(zhuǎn)染對Raji細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲的抑制作用。 此外，使用10ng/ml HGF蛋白、100ng/ml NK4蛋白分別處理NK4轉(zhuǎn)染細(xì)胞、HGF轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過觀察克隆形成能力、生長特點(diǎn)、mRNA表達(dá)、磷酸化c-MET蛋白等指標(biāo)的變化，評價NK4蛋白對Raji細(xì)胞的抑制作用和NK4基因轉(zhuǎn)染

10、對HGF蛋白的拮抗作用。結(jié)果在第一部分，我們構(gòu)建了的重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-NK4、pGEM-TEasy-C-MET和pMD19-T Simple-HGF，分別作為NK4 mRNA、c-METmRNA和HGF mRNA的定量標(biāo)準(zhǔn)。分別設(shè)計第二引物對和探針，優(yōu)化了引物、探針、dNTPs和MgCl2的濃度和反應(yīng)條件，建立了分別檢測NK4 mRNA、c-MET mRNA和HGF mRNA的實(shí)時FQ-PCR。經(jīng)方法學(xué)評價試驗證實(shí)：NK4

11、、c-MET和HGF的mRNA實(shí)時FQ-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率分別為-3.5 13±0.028、-3.680±0.073、-3.710±0.011，相關(guān)系數(shù)分別為0.999、0.996、0.998，擴(kuò)增效率分別達(dá)92.6±1.0％、87.6±1.4％、86.0±0.4％；批內(nèi)、日內(nèi)、日間變異系數(shù)分別為2.1％、4.0％、6.8％，1.9％、3.9％、7.0％，2.5％、3.1％、8.3％；靈敏度分別達(dá)2、5、5拷貝/μl。 篩選后

12、確定上層膠瓊脂糖濃度為0.3％、細(xì)胞濃度為1000個/孔，結(jié)合0.5％瓊脂糖底層膠建立半固體培養(yǎng)體系。經(jīng)RT-PCR獲得全長序列的NK4 cDNA和HGF cDNA，并由此構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-HGF Whole，經(jīng)PCR、酶切和測序等證實(shí)NK4 cDNA和HGF cDNA成功重組并保持序列完整和正確。 在第二部分，重組質(zhì)粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-H

13、GFWhole分別轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞。潮霉素B篩選后的轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)RT-PCR確認(rèn)存在目的片段，培養(yǎng)液中NK4蛋白、HGF蛋白含量分別為4.14±0.19ng/ml和5.38±0.31ng/ml，免疫細(xì)胞組化結(jié)果呈陽性，提示轉(zhuǎn)染成功，獲得轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。 NK4轉(zhuǎn)染細(xì)胞和HGF轉(zhuǎn)染細(xì)胞達(dá)生長曲線峰值的時間分別為5天和3天，與對照組(未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞、空載體pVITRO2轉(zhuǎn)染細(xì)胞均為4天)相異；前者形成的細(xì)胞團(tuán)較小、邊緣整齊、散在細(xì)胞少，而后者

14、的細(xì)胞團(tuán)松散、邊緣不整齊、細(xì)胞呈擴(kuò)散性生長；兩組的c-MET mRNA分別為5.71±0.29和6.48±0.18，磷酸化c-MET蛋白分別為3.35±0.38U/ml和4.96±1.18U/ml；克隆形成數(shù)分別為64.39±4.63/孔和124.61±5.16/孔，與對照組相比，差異顯著(P＜0.001)，兩組間差異也具高度統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。結(jié)果提示，NK4基因轉(zhuǎn)染抑制了Raji細(xì)胞的生長，而HGF基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)了其生長。

15、 此外，NK4蛋白處理的HGF轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的克隆形成能力降低(89.78±5.38/孔)、處理后10min的c-MET mRNA增高(7.67±0.20)、HGF mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(9.16+0.14)而磷酸化c-MET蛋白降低(8.97±1.19U/ml)；HGF蛋白處理的NK4轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的克隆形成能力明顯增加(64.39±4.63/孔)、處理后10min的c-MET mRNA明顯增強(qiáng)(8.10±0.22)、NK4 mRNA(

16、9.73±0.34)和磷酸化c-MET蛋白(65.24±2.04U/ml)均顯著增強(qiáng)，分別與對照組及未處理組的差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。提示NK4蛋白促進(jìn)了HGF轉(zhuǎn)染細(xì)胞c-MET mRNA、HGF mRNA的應(yīng)激性表達(dá)加強(qiáng)，而抑制了克隆的形成和c-MET蛋白磷酸化；HGF蛋白有助于NK4轉(zhuǎn)染細(xì)胞的克隆形成，促進(jìn)c-MET mRNA、NK4mRNA的表達(dá)和c-MET蛋白的磷酸化。研究結(jié)論1.構(gòu)建了定量標(biāo)準(zhǔn)，分別建立了HG

17、F mRNA、NK4 mRNA和c-MET mRNA相應(yīng)的實(shí)時FQ-PCR。 2.建立了適宜的半固體培養(yǎng)體系。 3.構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-HGF Whole。 4.成功轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，獲得NK4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和HGF基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。 5.NK4基因轉(zhuǎn)染對Raji細(xì)胞具抑制作用，而HGF基因轉(zhuǎn)染則具促進(jìn)作用。 6.NK4蛋白抑制HGF基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞