光動力學療法凈化異基因活化T細胞預防aGVHD的實驗研究.pdf

1、　　目的：
　　建立Rhodamine123(Rh123)介導的光動力學療法,觀察光動力學療法對小鼠及人淋巴細胞增殖、活化功能的影響；對小鼠骨髓造血干祖細胞集落形成的影響；探討光動力學療法在選擇性滅活對宿主抗原特異反應的人活化T淋巴細胞時,保留靜息T細胞對新的第三抗原的反應活性的特性；觀察光動力學療法在小鼠異基因骨髓移植中預防急性移植物抗宿主病(aGVHD)的作用,探討光動力學療法調(diào)控預防aGVHD的可行性及安全性。
　　方

2、法：
　　1 光動力學療法實驗條件的建立：選擇氬離子激光器(波長514 nm)。取BALB/c小鼠脾單個核細胞(MNC),經(jīng)絲裂霉素滅活作為刺激細胞,C57BL/6小鼠脾MNC作為反應細胞, 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱混合淋巴細胞培養(yǎng)72 h,做如下四種處理：(1)加入Rh123(50 nmol/L),分組孵育不同時間,流式細胞儀檢測不同時間點細胞對Rh123熒光攝取率及平均熒光強度；(2)混合淋巴細胞加入不同濃度Rh123(終濃

3、度分別為10 nmol/L-60 nmol/L),MTT法測A570；(3)混合淋巴細胞接受不同劑量的激光照射(功率密度10 mW/cm2-60 mW/cm2,分組照射3 min或4 min),MTT法測A570；(4)混合淋巴細胞先加Rh123(50 nmol/L),再接受激光照射(功率密度10 mW/cm2-60 mW/cm2,照射3 min或4 min),繼續(xù)培養(yǎng)24 h,MTT法測A570。博士學位論文：光動力學療法凈化異基因活

4、化T細胞預防aGVHD的實驗研究摘要2光動力學療法對小鼠骨髓造血干祖細胞集落形成的影響：取c57BL/6小鼠骨髓MNC,加燦123(30 runol/L、40 nrnol/L、50 nrnol/L、60 nmol幾)孵育,接受激光照射(功率密度分別為10 mw/cmZ、20 mw/emZ、30 mw/emZ、50mw/c mZ),37℃、5%c02培養(yǎng)箱培養(yǎng)14d。多功能倒置顯微鏡下觀察,計數(shù)粒巨噬細胞集落形成單位(CFU一GM)集落。

5、3光動力學療法對小鼠T淋巴細胞早期活化指標CD69+表達的影響：小鼠混合淋巴細胞培養(yǎng)24h,加燦1 23(50 nmol幾)、激光30 mwzemZ照射3 min。流式細胞儀檢測CD3+CD69+陽性表達率。4光動力學療法對宿主抗原特異反應人淋巴細胞的選擇性滅活：取健康人A、B、C來源的三份外周血MNC,A、C作為刺激細胞預先經(jīng)絲裂霉素滅活,B作為反應細胞；按刺激細胞刀反應細胞B(S瓜)比例1：1混合,于%孔板,37oC、5%COZ培養(yǎng)

6、箱培養(yǎng)72h；取出細胞,加Rhl23孵育(50nmol/L) 40min,分別接受激光不同功率密度(10 mwzemZ、30 mw/emZ、50 mw/e時)照射3 min；將經(jīng)以上光動力學處理的混合細胞再做如下2種處理：(l)再加入刺激細胞A： 2)再加入刺激細胞C,繼續(xù)培養(yǎng)24h；MTI,法測A570。5小鼠異基因骨髓移植急性移植物抗宿主病(aGvHD)模型建立：以BALB/cH一Zd為受鼠,C57B/6H一b為供鼠。預處理方案為

7、全身照射(TBI),“oCo,8, 0 oy,劑量率：0.7513。oy/min。BALB/?！耙籞d受鼠照射后6h經(jīng)尾靜脈注射C57B/6H一Zb供鼠骨髓(總數(shù)4x一06)+e57a/6H‘Zb供鼠脾臟淋巴細胞(總數(shù)4 x 106)。設注射生理鹽水組、同基因骨髓移植組、異基因骨髓移植組為對照。6光動力學療法預防aGVHD的小鼠移植實驗：將c57B/6H一2b供鼠骨髓(4丫106)與經(jīng)過光動力學處理的混合淋巴細胞(總數(shù)4.0x106)混

8、合,移植給BALB/cH一2d受鼠。觀察移植后小鼠aGvHD發(fā)生及存活情況。取小鼠的肝、脾、肺、皮膚、腸、骨髓組織,制片,HE染色,觀察病理。結果1建立光動力學療法實驗條件：(1)以氫離子激光器(波長514tun)為光源,肋123為光敏劑；(2)燦123孵育濃度為50nmol/L；(3)助123孵育時間為40min,博士學位論文：光動力學療法凈化異墓因活化T細胞預防aGvHD的實驗研究摘要 4)激光照射功率密度為30 mw/cmZ；(

9、5)激光照射時間為3min。2小鼠骨髓造血干祖細胞集落形成：單純Rh 123及單純激光照射對cFU一GM集落形成的影響無顯著差異。光動力學組中,30 mw/c mZ以下照射劑量對cFu一GM集落無明顯影響；50 mw/c mZ以上照射劑量明顯抑制CFU一GM集落形成。3光動力學療法對小鼠T淋巴細胞早期活化指標CD69+表達的影響：光動力學處理后,混合淋巴細胞培養(yǎng)體系的 CD3+CD69+表達明顯下降(P<；0.05)。4光動力學療法

10、對宿主抗原特異反應的人淋巴細胞的選擇性滅活：將經(jīng)過光動力學處理后的混合淋巴細胞分組,分別加入第一次混合培養(yǎng)時的同一宿主刺激細胞A或另加入一新的外來異基因刺激細胞C；分別再繼續(xù)培養(yǎng)24h,當激光功率密度為30mw/c mZ時,光動力學處理細胞+原宿主刺激細胞A組的A570值明顯低于光動力學處理后細胞+新刺激細胞C組(P<；0.05)。5光動力學療法預防小鼠異基因骨髓移植中aGVHD的實驗：生理鹽水組小鼠均于15d內(nèi)死亡。同基因骨髓+同

11、基因脾臟淋巴細胞移植組100%存活,異基因骨髓+異基因脾臟淋巴細胞移植組(aGVHD組)自第1 ld開始出現(xiàn)典型的aGVHD表現(xiàn),在22d內(nèi)死亡。光動力學治療組也不同程度出現(xiàn)以上aGVHD表現(xiàn),但臨床表現(xiàn)及病理程度減輕,且存活小鼠數(shù)量增多,aGVHD組和光動力學組間生存率有顯著差異(P<；0.05)。結論u建立光動力學療法實驗條件：(l)以氫離子激光器為光源,Rh123為光敏劑；(2) Rhl23孵育濃度為50 tunol幾；(3