光感基因活化嗅鞘細(xì)胞的體外研究.pdf

1、目的：目前細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷研究中存在兩大不足：一，對脊髓損傷再生微環(huán)境中抑制因素的拮抗不夠；二，對移植入脊髓內(nèi)細(xì)胞的調(diào)控不足。研究表明，即便將細(xì)胞移植入脊髓內(nèi)，脊髓再生微環(huán)境中仍存在大量的軸突再生抑制因子。最近的研究發(fā)現(xiàn)軸突胞膜上的Nogo受體復(fù)合體（NgR/p75NTR/Lingo-1）是發(fā)揮抑制軸突再生和髓鞘形成的作用共同通道，親水的Lingo-1片段(Lingo-1-Fc)可通過對NgR結(jié)合位點(diǎn)的競爭，阻礙Lingo-1和Ng

2、R的結(jié)合，抑制Lingo-1的作用，從而拮抗再生微環(huán)境中的抑制因子。另外，細(xì)胞移植入損傷脊髓后，尚缺乏對植入體內(nèi)細(xì)胞功能狀態(tài)的活化及調(diào)控。OEG細(xì)胞已被廣泛的應(yīng)用于脊髓損傷的基礎(chǔ)研究，并顯示出了神經(jīng)保護(hù)、穿越疤痕、再髓鞘化，及促進(jìn)軸突再生的作用。光感基因ChR2能夠穩(wěn)定的表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，其為膜陽離子通道蛋白，經(jīng)波長470nm藍(lán)光刺激后產(chǎn)生鈉離子內(nèi)流引發(fā)動(dòng)作電位，使神經(jīng)元興奮。既往研究表明大腦星型細(xì)胞可被光感基因調(diào)控，能否使用光感基因

3、技術(shù)活化OEG細(xì)胞，同時(shí)使其分泌Lingo-1-Fc片段拮抗再生抑制因子，增強(qiáng)其修復(fù)脊髓損傷的作用。本研究試圖通過光感基因活化OEG的體外研究探討此問題，為OEG細(xì)胞體內(nèi)移植后的光基因調(diào)控活化，提供科學(xué)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，以達(dá)到脊髓損傷微環(huán)境中促進(jìn)因素和抑制因素的協(xié)調(diào)，獲得更佳的修復(fù)效果。
　　方法：構(gòu)建光感基因ChR2和大鼠Lingo-1-Fc基因的慢病毒載體，體外轉(zhuǎn)染大鼠OEG細(xì)胞，使用RT-PCR、ELISA、細(xì)胞內(nèi)蛋白定位技術(shù)

4、驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功，即光感基因ChR2及Lingo-1-Fc蛋白的表達(dá)。根據(jù)LED閃光電路，自行設(shè)計(jì)制備LED藍(lán)光光照裝置，使用藍(lán)光體外照射刺激OEG細(xì)胞，觀察光刺激后OEG細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)，重點(diǎn)觀察體外OEG細(xì)胞經(jīng)光感基因調(diào)控后的存活、增殖、遷徙、分泌等功能的變化情況。采用光刺激后OEG細(xì)胞培養(yǎng)的上清液培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，觀察其對神經(jīng)細(xì)胞的營養(yǎng)保護(hù)作用。
　　結(jié)果：構(gòu)建的慢病毒載體能夠有效、安全、高效的轉(zhuǎn)染OEG細(xì)胞，其最佳的轉(zhuǎn)染

5、MOI為10。OEG細(xì)胞內(nèi)能夠檢測到目的基因的表達(dá)和分泌；藍(lán)光LED光源波長為470nm，輻射照度能夠達(dá)到光感基因調(diào)控刺激細(xì)胞的條件。與單純純化的OEG相比，藍(lán)光刺激后期OEG細(xì)胞可以明顯的增強(qiáng)其增殖活性，增加了神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，增強(qiáng)了OEG細(xì)胞的體外遷徙能力，增強(qiáng)了其對神經(jīng)細(xì)胞的營養(yǎng)保護(hù)作用。
　　結(jié)論:OEG細(xì)胞可被光感基因技術(shù)調(diào)控和活化；體外光刺激增強(qiáng)了OEG細(xì)胞的生理功能；光活化的OEG細(xì)胞促進(jìn)了OEG的神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌