受體介導(dǎo)的HCV入侵小鼠肝癌細(xì)胞研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是一種經(jīng)血液傳播的RNA病毒，呈全球性流行。全世界有近1.7億人感染，每年的新發(fā)病例約有350萬(wàn)例，感染率約3％。HCV感染機(jī)體后會(huì)引起急性肝炎，其中約75％以上會(huì)轉(zhuǎn)化為慢性肝炎，并逐步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。由于治療方法有限且缺乏合適的疫苗，使得丙型肝炎防治一直是世界性難題，也引起了眾多研究學(xué)者的關(guān)注。HCV具有嚴(yán)格的種屬特異性，只能感染人類和黑猩猩。在實(shí)驗(yàn)研究中，由于

2、價(jià)格昂貴及倫理等問(wèn)題難以獲得黑猩猩，導(dǎo)致目前還缺乏有效的可用于HCV感染性研究的細(xì)胞及動(dòng)物模型，這也極大阻礙了HCV感染性研究的進(jìn)程。
　　HCV感染靶細(xì)胞是一個(gè)由多分子共同作用的復(fù)雜過(guò)程。大部分研究者認(rèn)為，介導(dǎo)HCV進(jìn)入靶細(xì)胞的主要受體分子包括低密度脂蛋白受體(Low-DensityLipoprotein Receptor,LDLR)、CD81、B族Ⅰ型清道夫受體(Scavenger Receptor ClassB TypeⅠ，

3、SR-BⅠ)、緊密連接區(qū)域Claudin-1(CLDN-1)和occludin(OCLN)，且CD81和OCLN是HCV進(jìn)入靶細(xì)胞必不可少的兩個(gè)分子。HCV與低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)或者極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)結(jié)合形成復(fù)合物(lipoviral particles，LVPs)，肝細(xì)胞膜表面的葡聚糖氨基聚糖類(glycosaminog

4、lycans，GAGs)和低密度脂蛋白受體LDLR可以使LVPs結(jié)合到靶細(xì)胞表面，通過(guò)膜表面其它的HCV受體分子共同作用，最終經(jīng)網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)的胞吞作用及低pH引發(fā)病毒包膜與內(nèi)體膜的融合，使得HCV衣殼釋放，進(jìn)入胞漿。
　　盡管CD81和OCLN兩個(gè)分子就可引起病毒進(jìn)入，但其它受體分子在HCV進(jìn)入肝細(xì)胞時(shí)的權(quán)重或聯(lián)合作用能否進(jìn)一步促進(jìn)病毒進(jìn)入還不甚清楚;介導(dǎo)HCV入胞的相關(guān)受體分子是如何參與病毒早期感染的也需要進(jìn)

5、一步探討。
　　本課題的目的是構(gòu)建能夠體外感染HCV的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞模型，并在細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究介導(dǎo)HCV入胞的受體分子在病毒對(duì)靶細(xì)胞內(nèi)源化過(guò)程中的作用。研究結(jié)果如下：
　　一、轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞株的篩選。通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方法，篩選能夠穩(wěn)定表達(dá)HCV多種受體分子的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞株。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將串聯(lián)表達(dá)介導(dǎo)HCV感染相關(guān)受體分子的重組慢病毒載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞，包裝相應(yīng)慢病毒;將包裝的慢病毒

6、攻擊小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6，熒光活細(xì)胞法或加壓篩選得到過(guò)表達(dá)HCV多種膜受體分子的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞株。RT-PCR、激光共聚焦顯微鏡和免疫印跡均檢測(cè)到相應(yīng)受體分子的表達(dá)。
　　二、構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞株可使HCVpp內(nèi)源化。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法，將構(gòu)建的表達(dá)HCV包膜蛋白和螢火蟲(chóng)熒光素酶的兩個(gè)重組載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞，包裝病毒HCVpp;用HCVpp病毒孵育轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，可檢測(cè)到內(nèi)源化的HCVpp。
　　三、

7、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株SCCO/Hepa1-6和LSCCO/Hepa1-6能使HCV病毒自然感染，且介導(dǎo)HCV入胞的受體分子按照LDLR-SR-BⅠ-CD81和CLDN-1-OCLN的排列順序更易促進(jìn)病毒入侵靶細(xì)胞。通過(guò)HCV陽(yáng)性血清直接感染實(shí)驗(yàn)，證實(shí)篩選的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株可被HCV病毒自然感染，且LDLR能促進(jìn)血清病毒進(jìn)入;利用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法篩選出LDLR-CD81-SR-BⅠ和CLDN-1-OCLN串聯(lián)順序表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞株LCSCO/

8、Hepa1-6;通過(guò)比較轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株LSCCO/Hepa1-6和LCSCO/Hepa1-6對(duì)血清中HCV病毒的易感性，發(fā)現(xiàn)HCV更易進(jìn)入LSCCO/Hepa1-6細(xì)胞內(nèi)，這可能與該細(xì)胞膜表面的HCV受體分子排列順序有關(guān)，即HCV受體分子的排列順序?qū)Σ《救肭钟杏绊憽?br>　　四、由于HCV存在形式的不同，導(dǎo)致HCVcc感染與病毒自然感染不同，LDLR在HCVcc病毒內(nèi)源化中所起作用不顯著。通過(guò)比較兩種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株SCCO/Hepa1-6

9、和LSCCO/Hepa1-6對(duì)HCVcc的結(jié)合及進(jìn)入，未發(fā)現(xiàn)LDLR的存在對(duì)HCVcc進(jìn)入有明顯的影響;為排除分子串聯(lián)對(duì)其可能存在的影響，使之更接近體內(nèi)狀態(tài)，故將串聯(lián)的重組慢病毒載體進(jìn)行改構(gòu)并構(gòu)建單分子表達(dá)的慢病毒載體;經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系Hepa1-6后孵育HCVcc，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HCVRNA拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)，各受體分子單獨(dú)表達(dá)與串聯(lián)表達(dá)時(shí)，病毒內(nèi)源化基本一致;考慮到病毒自然感染與HCVcc感染時(shí)病毒存在形式不同，以及不同病毒入胞與其結(jié)合的受

10、體分子也不同，故將LDLR和SR-BⅠ對(duì)HCVcc進(jìn)入靶細(xì)胞過(guò)程的作用做了比較;發(fā)現(xiàn)，SR-BⅠ是HCVcc感染的必需分子。研究結(jié)果表明，HCVcc感染和自然感染不同，靶細(xì)胞膜表面介導(dǎo)HCV入胞的受體分子LDLR對(duì)HCVcc感染影響不明顯。
　　綜上所述，本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)不同數(shù)量和不同串聯(lián)順序的HCV相關(guān)受體分子的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌細(xì)胞株SCCO/Hepa1-6、LSCCO/Hepa1-6和LCSCO/Hepa1-6;證實(shí)了這些轉(zhuǎn)

11、基因細(xì)胞株可引起病毒內(nèi)源化，并有望作為細(xì)胞模型用于體外HCV感染的相關(guān)研究;通過(guò)比較細(xì)胞株LSCCO/Hepa1-6和LCSCO/Hepa1-6對(duì)HCV陽(yáng)性血清的易感性，證實(shí)了HCV在進(jìn)入靶細(xì)胞時(shí)要優(yōu)先與SR-BⅠ作用;通過(guò)比較細(xì)胞株SCCO/Hepa1-6和LSCCO/Hepa1-6對(duì)HCVcc的易感性，證實(shí)SR-BⅠ是介導(dǎo)HCVcc早期入胞的關(guān)鍵分子，且HCVcc感染與病毒自然感染的早期入胞過(guò)程不同，LDLR在HCVcc早期入胞中作