siRNA介導的雄激素受體抑制及其在肝癌細胞株細胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：AR在HCC的發(fā)病和發(fā)展中起著重要作用。AR可調節(jié)多個靶基因的表達。尚不清楚AR是否可以調節(jié)PEGl0和Caspase-12的表達。RNAi通過啟動RNA雙鏈，特異性地降解相應序列的靶mRNA而引起的同源基因表達沉默。在此，我們先在肝癌細胞株探討化學合成的siRNA雙鏈對AR的抑制作用，再探討AR對PEG 10和Caspase-12表達的調控作用，最后進一步探討RNAi介導的AR抑制在HepG2細胞凋亡中的作用。 方法：

2、設計靶向人AR的siRNAs(AR siRNAs-943，AR siRNAs-2125.ARsiRNAs-2859)。以靶向SARS-CoY基因的雙鏈siRNA作為陰性對照。化學合成結尾為TT的2l nt RNA，并行退火處理。用含10％胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)HepG2和7404細胞。用脂質體轉染siRNAs進入細胞。通過用胎盤藍染色計數(shù)從培養(yǎng)板中去除的細胞檢測細胞活力。用TRIZOL試劑抽提總RNA，并用RT-PCR檢測mRNA水平

3、。抽提總蛋白，用western blot檢測AR。構建人PEGlO表達質粒，并在大腸桿菌中表達。純化蛋白。制備兔源性抗PEGl0多克隆抗體。用5-氟尿嘧啶誘導細胞凋亡，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。 結果：(一)3對AR siRNAs雙鏈體中，siRNAs-2859雙鏈體在mRNA和蛋白水平同時特異地抑制AR基因的表達，濃度為240nM時抑制作用最大，達80％以上。siRNAs-2859雙鏈體可特異地劑量依賴地降低7404細胞AR

4、基因的表達。濃度為240 nM AR siRNAs-2859轉染HepG2和7404細胞后，AR siRNAs-2859抑制作用可持續(xù)72h以上。AR siRNAs-2859和對照siRNAs處理培養(yǎng)液活細胞和死細胞總數(shù)無顯著差異，表明所得的AR基因表達下調不是AR siRNAs-2859雙鏈體的毒性作用所致。 (二)不同濃度的雙鏈siRNA轉染HepG2和H7404細胞，可特異地以劑量依賴的方式降低HepG2和7404細胞A

5、R表達水平。HepG2～17404細胞中，PEG 10和Caspase-12表達抑制亦存在劑量依賴性。用濃度為240nM的ARsiRNAs-2859轉染HepG2和7404細胞，24h，48h，和72h后PEG10和Caspase-12表達水平抑制作用達80％以上，且持續(xù)72h。24h后可見ARsiRNAs-2859介導的PEG10和Caspase-12表達抑制，48h后抑制作用達到最大，72h后開始減弱。雄激素可促進HepG2細胞PE

6、GlO和Caspase-12的表達，但對AR表達未見明顯作用。 (三)用不同濃度的雙鏈siRNA轉染HepG2細胞。24h后用5-Fu處理細胞，12h后AR抑制的HepG2細胞凋亡明顯增加，且與雙鏈siRNA濃度存在劑量依賴性。用濃度為240 nM的AR siRNAs-2859轉染HepG2細胞，24h后用5-Fu處理細胞，AR抑制的HepG2細胞48h內無明顯變化。 結論：化學合成的slRNAs 能以劑量依賴地的方