Annexin Ⅱ受體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究Tmed2促進(jìn)小鼠前成骨細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、我的工作主要包含兩部分內(nèi)容：
　　 一、AnnexinⅡ受體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究
　　 隨著人們對(duì)凋亡的認(rèn)識(shí)逐漸深入，對(duì)凋亡發(fā)生的分子機(jī)制的了解也越來(lái)越透徹，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)這一過(guò)程遠(yuǎn)非原來(lái)想象的那樣簡(jiǎn)單，而是包含了復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。盡管近幾年在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、凋亡的生化反應(yīng)機(jī)制以及凋亡的基因調(diào)控等方面的研究都取得了顯著的進(jìn)展，但仍有許多問(wèn)題迄今尚未闡明。
　　 本文的研究對(duì)象人類(lèi)鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅱ受體humanAnne

2、xinⅡreceptor(簡(jiǎn)稱(chēng)AXIIR)，又稱(chēng)為C50rf39，是一個(gè)具有193個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其編碼基因位于人類(lèi)染色體5p12區(qū)。通過(guò)基因序列比對(duì)和PCR檢測(cè)認(rèn)為AXIIR僅存在于人類(lèi)第5號(hào)染色體上而不存在于其他種屬，是人類(lèi)所特有的基因。AXIIR最先是在2006年，研究者從人類(lèi)骨髓cDNA文庫(kù)中尋找AnnexinⅡ的受體時(shí)被克隆出來(lái)的，推測(cè)為Ⅰ型膜蛋白，研究認(rèn)為AXIIR表達(dá)在骨髓基質(zhì)細(xì)胞的表面，介導(dǎo)AnnexinⅡ的信號(hào)傳導(dǎo)而

3、促進(jìn)成骨細(xì)胞形成。而隨后對(duì)于該基因的功能研究結(jié)果也僅僅是認(rèn)為其作為AnnexinⅡ的細(xì)胞膜受體來(lái)介導(dǎo)AnnexinⅡ的信號(hào)傳遞。該基因的功能研究還處于早期階段，更沒(méi)有任何證據(jù)證明其與細(xì)胞凋亡相關(guān)。
　　 AnnexinⅡ是鈣磷脂結(jié)合蛋白(Annexin)家族中的一個(gè)重要成員，存在于細(xì)胞膜、胞質(zhì)和胞外。AnnexinⅡ具有廣泛的功能，AnnexinⅡ與一系列細(xì)胞外基質(zhì)成分相互作用，參與許多細(xì)胞膜相關(guān)事件，如細(xì)胞外吐和內(nèi)吞，細(xì)胞黏附

4、，纖溶酶原激活，腫瘤遷移和侵襲。
　　 在本研究中，首先通過(guò)在人髓性白血病K562細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)AXIIR基因，確證該基因高表達(dá)時(shí)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)AXIIR能引起其他人類(lèi)細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡，但細(xì)胞死亡比例均低于K562細(xì)胞，說(shuō)明AXIIR誘導(dǎo)人類(lèi)細(xì)胞凋亡存在一定的普遍性，但也與特定細(xì)胞類(lèi)型有關(guān)。
　　 在目前的文獻(xiàn)報(bào)道中，AXIIR均是作為AnnexinⅡ的細(xì)胞膜受體來(lái)介導(dǎo)AnnexinⅡ的信號(hào)傳遞，所以

5、我們需要了解AXIIR的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能是否由AnnexinⅡ信號(hào)引起。首先，我們通過(guò)免疫熒光染色方法定位AXIIR-myc分布在細(xì)胞漿中。另外，蛋白酶體抑制劑MG132處理并未增加AXIIR的蛋白水平，這也排除了胞漿內(nèi)的AXIIR在被溶酶體和泛素化降解的可能性。AnnexinⅡ在一個(gè)廣泛的濃度范圍內(nèi)并不能影響AXIIR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，說(shuō)明AXIIR并不是作為AnnexinⅡ的受體來(lái)誘導(dǎo)凋亡的。
　　 為了了解AXIIR誘導(dǎo)

6、細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們檢測(cè)了凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量和活性，主要包括幾種caspase和Bcq-2家族成員Bcq-2和BCL-XL。在AXIIR引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Caspase8,3均被激活。Caspase8抑制劑的使用也證實(shí)了Caspase8在AXIIR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能中發(fā)揮的重要作用。而隨后的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明AXIIR結(jié)合并激活pro-Caspase8，卻并不依賴(lài)于FADD。此外，下調(diào)FADD的表達(dá)并不會(huì)影響AXIIR激活Casp

7、ase8的能力。另外AXIIR截短體表達(dá)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明Caspase8的羧基端對(duì)于Caspase8的激活是必需的，當(dāng)然氨基端也發(fā)揮了一定作用。再者，在死亡受體誘導(dǎo)形成的DISC中并未檢查到AXIIR的表達(dá)，說(shuō)明AXIIR沒(méi)有參與死亡受體誘導(dǎo)的Caspase8激活。
　　 在我們的研究中，AXIIR不僅激活Caspase8，也同時(shí)激活了Caspase9和下調(diào)了BCL-2和BCL-XL的蛋白水平，而B(niǎo)ax水平無(wú)變化。BCL-XL高表達(dá)阻斷

8、線(xiàn)粒體途徑對(duì)AXIIR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡沒(méi)有影響。這說(shuō)明線(xiàn)粒體途徑在AXIIR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中并不是必需的，激活的Caspase8足以直接激活Caspase3引起凋亡。
　　 我們進(jìn)一步分析了AXIIR在不同細(xì)胞類(lèi)型中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AXIIR的mRNA很容易被檢測(cè)到，而蛋白卻幾乎不能夠檢測(cè)到。提示我們：AXIIR從mRNA到蛋白的翻譯過(guò)程受到嚴(yán)格調(diào)控。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)AXIIR翻譯抑制是受其5’UTR區(qū)的調(diào)控。雖然我們嘗試用幾種死亡

9、受體的配體、抗癌藥和紫外線(xiàn)照射的方法來(lái)找到可以使AXIIR的翻譯被激活的信號(hào)，但是并沒(méi)有獲得成功，這仍然需要進(jìn)一步研究。
　　 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了AXIIR除了作為細(xì)胞表面受體介導(dǎo)信號(hào)以外，還分布在細(xì)胞漿中，并主要通過(guò)激活Caspase8來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們的研究揭示了AXIIR的新功能和激活Caspase8的一種新的方式，為對(duì)凋亡發(fā)生的分子機(jī)制的研究提供了新的線(xiàn)索。
　　 二、Tmed2促進(jìn)小鼠前成骨細(xì)胞增殖功能研究

10、 我們實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)隨機(jī)siRNA文庫(kù)的篩選得到了一些與小鼠MC3T3-El前成骨細(xì)胞增殖相關(guān)的基因。我們通過(guò)基因上調(diào)和下調(diào)的方法對(duì)Tmed2基因促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的功能進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)MTS、細(xì)胞周期分布檢測(cè)、相關(guān)周期蛋白表達(dá)水平檢測(cè)等方法證明該基因通過(guò)上調(diào)CyclinA的表達(dá)水平,增高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞S期比例,從而促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖加快。此外,MC3T3-E1細(xì)胞在雌激素作用下增殖加快,此時(shí)Tmed2表達(dá)水平增