慢病毒介導(dǎo)的shRNA靶向干擾mTOR基因NIH-3T3穩(wěn)定細胞株的建立和有效干擾靶點的篩選.pdf

1、目的：
　　建立穩(wěn)定抑制mTOR基因表達的小鼠成纖維細胞NIH/3T3細胞株，為探討AKT/mTOR信號通路在ARMD發(fā)生中的作用提供細胞模型，觀察mTOR基因沉默對相關(guān)蛋白的影響。
　　方法：
　　根據(jù)鼠源mTOR基因mRNA序列，設(shè)計并構(gòu)建3對shRNA干擾序列sh1:AGTACTGTAGCACCTTGGG; sh2: TCTTCTCTCTGTAGTCCCG; sh3:TGACAAGGAGATAGAACGG，分別與

2、質(zhì)粒GIPZ-GFP+Puro載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒（慢病毒載體質(zhì)粒）。將慢病毒載體質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染NIH/3T3細胞以包裝慢病毒，收集病毒上清感染NIH/3T3靶細胞，熒光顯微鏡觀察評價感染效率。以嘌呤霉素預(yù)實驗篩選出的嘌呤霉素濃度藥篩，擴大培養(yǎng)后得到穩(wěn)定細胞株。Trizol法提取RNA后，反轉(zhuǎn)錄出cDNA，應(yīng)用Real-time PCR檢測NIH/3T3細胞中mTOR在基因的表達;全蛋白提取法提取細胞蛋白并BCA法測定蛋白

3、濃度，應(yīng)用Western blot檢測NIH/3T3細胞中mTOR在蛋白水平的表達，篩選出干擾效果最佳的shRNA序列。
　　結(jié)果：
　　1、mTOR在小鼠成纖維細胞株NIH/3T3中的表達結(jié)果:PCR檢測發(fā)現(xiàn)在184 bp的位置出現(xiàn)了較亮條帶，說明mTOR基因表達量充足;條帶產(chǎn)物單一，未見雜帶，說明引物特異性較好，無明顯非特異性產(chǎn)物。Western blot蛋白水平檢測結(jié)果顯示mTOR蛋白灰度較深，產(chǎn)物單一?；蚣暗鞍姿?/p>

4、檢測結(jié)果均表明mTOR在小鼠成纖維細胞株NIH/3T3中的有較好的表達。
　　2、熒光鏡檢評價慢病毒感染及嘌呤霉素藥物篩選結(jié)果:感染NIH/3T3細胞3天后，熒光顯微鏡下觀察感染效率，各組感染效率均達90％。加用嘌呤霉素篩選3-6天，待空白對照細胞均死亡，穩(wěn)定細胞株建立形成。
　　3、有效干擾片段的篩選結(jié)果:Real—time PCR校正結(jié)果，低MOI，sh1:0.687±0.131; sh2:0.682±0.079; sh

5、3:0.547±0.066;陰性對照:0.996±0.036;空白對照:1.00。高MOI，sh1:0.529±0.073; sh2:0.435±0.090; sh3:0.284±0.028;陰性對照:0.808±0.120;空白對照:1.00。將空白對照作為參照，在低MOI組中，sh1、sh2和sh3的敲低效率分別為31.3％、31.8％和45.3％。在高MOI組中，sh1、sh2和sh3的敲低效率分別為47.1％、56.5％和71.

6、6％。Western blot檢測各組NIH/3T3細胞mTOR基因的蛋白表達，sh1、sh2和sh3 mTOR基因的蛋白表達均有不同程度減低。
　　結(jié)論：
　　本實驗針對小鼠mTOR基因mRNA序列，設(shè)計了三條干擾靶點，并設(shè)置了一條陰性對照，排除轉(zhuǎn)染序列本身對基因表達的干擾，成功構(gòu)建了mTOR shRNA慢病毒表達載體。通過對干擾序列抑制基因表達的初步分析，篩選出了最有效的干擾片段sh3。同時，載體系統(tǒng)帶有嘌呤霉素抗性基因

7、，慢病毒質(zhì)粒感染細胞后，用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基對感染細胞進行篩選，獲得了穩(wěn)定感染慢病毒載體的陽性克隆細胞株。本研究結(jié)果顯示，我們構(gòu)建的慢病毒RNA干擾載體對鼠NIH/3T3細胞具有較高的感染效率。RT-PCR和Westem blot檢測證實mTOR基因的mRNA和蛋白水平在感染攜帶干擾靶點的慢病毒后顯著降低，從而可以有效地沉默NIH/3T3細胞中的mTOR基因表達，這表明有效RNA干擾的靶點設(shè)計成功，為進一步研究mTOR基因在ARMD小